酵母富硒蛋白提取條件優化

鄧乾坤，紀彥宇，蔣 霞，王 斌，史學偉*

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000）

硒是第六主族元素，以有機硒[1]和無機硒[2]兩種形式存在于自然界中。無機硒主要有單質硒、硒化物、硒酸鹽等，具有較強的毒性[3]；有機硒主要包括硒代半胱氨酸、硒蛋氨酸、硒蛋白等，低毒或無毒[4]。硒是人體必需的微量元素，具有提高機體免疫力、抗衰老、防癌抗癌、調節維生素的吸收與消耗等功能[5]。硒缺乏嚴重時會導致心臟病、肌肉萎縮和人體機能的紊亂，克山病及大骨節病就是硒元素攝入不足時引起的疾病[6]。然而，攝入過多硒元素也會危害人體健康，世界衛生組織（world health organization，WHO）推薦健康成年人硒日攝入量為50 μg[7]。最傳統的補硒方式是將無機硒物質—亞硒酸鈉作為硒源[8]。然而，亞硒酸鈉具有毒性作用和腐蝕性作用，添加的劑量過多時會危害人體健康發生中毒現象。有機硒具有很強的生物活性，對人體的毒性作用較低，人體吸收利用率高[9]。用有機硒強化硒元素是功能性食品的研究熱點之一，具有廣泛的市場前景，如富硒茶葉[10]、富硒大蒜[11]、富硒水稻[12]、富硒食用菌[13]和富硒酵母[14]等。

富硒酵母是將酵母放入含有無機硒（亞硒酸鈉）的培養基中培養，其中一定數量的無機硒能被酵母同化為有機硒而變成富硒酵母[15]。富硒酵母具有富硒能力高、發酵條件簡單、周期短、產量高等優點，補硒價值極高[16]。釀酒酵母和產朊假絲酵母因具有較高富硒能力，常被用作有機硒載體[17]。在富硒酵母的細胞膜上會存在許多有機硒，大部分物質的存在形式為硒代半胱氨酸，少部分物質為硒代蛋氨酸和非氨基形式的有機硒化合物[18]。富硒酵母自身富含豐富的蛋白質、糖類和B族維生素等營養物質，在作為補硒的有機硒源之外，還可以提供其他的營養物質。富硒酵母可以作為安全的食品添加劑進行食用[19]，它對人體的毒性作用與無機硒相比危害小，副作用低[20]。尤其是在生物轉化率方面，富硒酵母細胞可以將硒通過生物代謝作用進行轉化，且高于無機硒的轉化效率，可以作為一種天然的生物制劑品進行開發[21]，食用富硒酵母產品與服用含有亞硒酸鈉的無機硒產品相比，前者更具有安全有效的優點，提高人體身體健康。綜合來看，把含有富硒酵母的產品作為一種良好的硒源來取代亞硒酸鈉等無機硒產品，可以提高人體補硒的安全性，并且將危害風險降到最低水平。

有機硒是由富硒酵母細胞把無機硒通過生物作用轉化到細胞內部的蛋白質以及多糖上面[22]。由于有機硒具有毒性小，人體吸收率高的優勢，在食品應用方面可開發為功能性食品添加劑。富硒酵母硒蛋白作為一種安全、有效的高富硒來源，在未來的市場上有著廣闊的應用前景[23]。本研究以實驗室前期分離的高富硒酵母XJ1-3為原料，通過單因素和響應面試驗優化酵母富硒蛋白提取條件，以期為酵母富硒蛋白在食品發酵工業應用提供基礎的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒酵母菌株：庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）XJ1-3，由本實驗室篩選和保藏在-80 ℃的超低溫冰箱中。

發酵液培養基：葡萄糖25 g，蛋白胨25 g，酵母浸粉8 g，亞硒酸鈉30 mg，水1 000 mL，pH6.0，121 ℃滅菌20 min。

體積分數90%乙醇、硫酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉（均為分析純）：北京奧博星生物技術公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；BS 2000S 型電子天平：上海西唐生物科技有限公司；DW-86L158-80 ℃超低溫冰箱：山東艾普儀器設備有限公司；B250電熱恒溫水浴鍋：上海予卓儀器有限公司；SW-CJ-2D無菌操作臺：蘇潔凈化設備有限公司；SPX-250B生化培養箱：常州諾基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母富硒蛋白的提取工藝

富硒酵母擴培：用滅菌環從斜面培養基中挑取富硒酵母接入15 mL試管（裝有9 mL發酵液培養基），30 ℃、180 r/min振蕩培養23 h，按10%接種量接種富硒酵母擴培液于250 mL發酵瓶中，根據測得的生長曲線確定富硒蛋白的提取時間。

發酵：將保存的富硒酵母菌株活化后接種于發酵液培養基中，30 ℃、180 r/min搖床培養24 h。

酵母富硒蛋白提取：培養24 h的發酵液培養基在4 ℃條件下，8 000 r/min離心15 min，用去離子水反復洗滌沉淀3次，傾去上清液，冷凍干燥獲得備用的富硒酵母干粉[24]。稱取上述富硒酵母干粉樣品1 g置于容器中，用0.10 mol/L NaOH溶液，按8∶1（mL∶g）的液料比于37 ℃條件下水浴振蕩提取120 min，然后放入180 r/min搖床中37 ℃保溫2 h，浸提液在4 ℃條件下8 000 r/min離心15 min，分離除去沉淀，保留上清液。

純化：在上清液中加入飽和度為50%的硫酸銨，于磁力攪拌器上勻速攪拌3 h，4 ℃沉淀過夜。將得到的上清液在4 ℃條件下，8 000 r/min離心15 min[25]。向得到的富硒蛋白沉淀中加入適量超純水在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中透析除鹽，經Sephadex G-75層析柱分離純化得到酵母富硒蛋白，以酵母富硒蛋白的提取率為最終指標。

1.3.2 酵母富硒蛋白提取條件優化單因素試驗

保持其他條件不變，只改變其中一個因素，分別考察NaOH濃度（0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L、0.20 mol/L、0.25 mol/L），液料比（5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1（mL∶g））、提取時間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min）對酵母富硒蛋白提取的影響，以酵母富硒蛋白的提取率為最終指標。

1.3.3 酵母富硒蛋白提取條件優化響應面分析試驗

在單因素試驗的基礎上，以NaOH濃度（A）、液料比（B）和提取時間（C）為3個評價因素，以酵母富硒蛋白提取率（Y）為響應值，采用Box-Behnken中心組合設計原理設計響應面試驗對酵母富硒蛋白提取條件進行優化[26]。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 酵母富硒蛋白提取條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for extraction conditions optimization of yeast selenium-enriched protein

1.3.4 測定方法

富硒蛋白含量的測定：采用考馬斯亮藍G-250法測定富硒蛋白，以牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）標準溶液的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制牛血清蛋白質溶液濃度的標準曲線[27]。得到牛血清蛋白溶液濃度標準曲線：Y=5.231 43X+0.008 43，利用該回歸方程計算富硒蛋白含量。

富硒蛋白提取率的計算方法：

式中：m1為浸取液中蛋白質的質量，g；m2為富硒酵母干粉的質量，g。

硒含量的測定：酵母富硒蛋白中硒含量的測定采用催化分光光度法，以硒含量作為橫坐標，吸光度值作為縱坐標，繪制硒的標準曲線[28]。

1.3.5 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行響應面優化試驗設計，運用該軟件的數據分析功能進行數據分析，建立回歸模型，并對建立的模型進行驗證，利用Origin 8.5和SPSS 22.0軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 酵母富硒蛋白提取條件優化單因素試驗

2.1.1 NaOH濃度對酵母富硒蛋白提取的影響

NaOH濃度對酵母富硒蛋白提取的影響見圖1。

由圖1可知，酵母富硒蛋白提取率隨NaOH濃度的增大呈先增大后減小的趨勢。當NaOH濃度由0.05 mol/L增加至0.10 mol/L時，酵母富硒蛋白提取率呈上升趨勢。NaOH濃度達到0.10 mol/L時，酵母富硒蛋白的提取率最大，為12.5%。NaOH濃度超過0.10 mol/L后，酵母富硒蛋白的提取率呈下降趨勢。推測可能是過高濃度的NaOH溶液會使部分蛋白質發生變性。因此選擇NaOH濃度為0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.15 mol/L進行后續試驗。

圖1 NaOH濃度對酵母富硒蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on extraction rate of yeast selenium-enriched protein

2.1.2 液料比對酵母富硒蛋白提取的影響

液料比對酵母富硒蛋白提取的影響見圖2。

圖2 液料比對酵母富硒蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of liquid and material ratio on extraction rate of yeast selenium-enriched protein

由圖2可知，酵母富硒蛋白提取率隨液料比的增大呈先增后減的趨勢。當液料比由5∶1增加至8∶1時，酵母富硒蛋白提取率呈上升趨勢。液料比為8∶1時，酵母富硒蛋白的提取率最大，為12.5%。液料比超過8∶1時，酵母富硒蛋白的提取率呈下降趨勢。推測發生這種現象的主要原因是，氫氧化鈉溶液與冷凍干燥后的富硒酵母粉末接觸不完全，細胞里面的富硒蛋白還無法全部溶解出來。因此選擇料液比值7∶1、8∶1、9∶1進行后續試驗。

2.1.3 提取時間對酵母富硒蛋白提取的影響

提取時間對酵母富硒蛋白提取的影響見圖3。

由圖3可知，酵母富硒蛋白提取率隨提取時間的增加呈先增大后減小的趨勢。當提取時間由30 min增加至120 min時，酵母富硒蛋白提取率呈上升趨勢。提取時間為120 min時，酵母富硒蛋白的提取率最大，為12.21%。提取時間超過120 min時，酵母富硒蛋白的提取率呈下降趨勢。推測發生這種現象的主要原因是，由于提取的時間過短氫氧化鈉溶液的濃度與富硒蛋白結合不完全，導致富硒蛋白不能夠全部溶解出來，產生富硒蛋白提取率低的情況。因此選擇提取時間為90 min、120 min、150 min 進行后續試驗。

圖3 提取時間對酵母富硒蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of yeast selenium-enriched protein

2.2 酵母富硒蛋白提取條件優化響應面試驗結果分析

酵母富硒蛋白提取條件優化響應面分析試驗結果與分析見表2，回歸模型的方差分析見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 回歸模型的回歸系數的顯著性檢驗與方差分析Table 3 Significant tests and variance analysis of regression coefficient of regression model

對表3的數據用Design Expert軟件進行分析，進行三元二次回歸方程擬合，獲得的響應值為酵母富硒蛋白的提取率對編碼自變量的二次項回歸方程：

由回歸模型方差分析結果（表3）可以看出，模型P＜0.000 1說明試驗所選用的二次多項模型極顯著。一次項A、C，二次項A2、B2、C2對酵母富硒蛋白提取率的影響極顯著（P＜0.01），交互項AC對酵母富硒蛋白提取率的影響顯著（P＜0.05）。影響酵母富硒蛋白提取率的主次因素依次為A＞C＞B，即NaOH濃度＞提取時間＞液料比。失擬項P=0.201 3＞0.05不顯著，表明所建立的回歸二次模型成立，調整決定系數R2Adj=0.947 3，表明可用此模型這說明該模型解釋酵母富硒蛋白提取提取率有94.73%，具有可靠性，富硒蛋白的提取率變化可由虛擬模型解釋。決定系數R2為0.977 0，這個數據表明響應值的實測值與預測值之間具有非常高的相關性。通過這個方差顯著性分析數據能夠說明Design-Expert 8.0.6軟件建立的這個模型能夠通過擬合值來代表真實值，響應面法的最終預測出的酵母富硒蛋白提取工藝與真實的提取工藝相近，這種預測方法具有代表性。

由圖4可知，在液料比為8∶1（mL∶g）時，NaOH濃度不變，隨著提取時間的延長，富硒蛋白提取率逐漸增加達到最大值。提取時間一定時，持續增加NaOH濃度，富硒蛋白提取率逐漸增加達到最大值。NaOH濃度與提取時間的交互作用影響顯著，與方差分析顯著性結果相一致。

圖4 NaOH濃度與提取時間交互作用對酵母富硒蛋白提取率影響的響應曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between NaOH concentration and extraction time on the extraction rate of yeast selenium-enriched protein

酵母富硒蛋白最佳提取工藝參數為NaOH濃度0.11mol/L、液料比為7.51∶1（mL∶g）、提取時間139.81 min。在此條件下，酵母富硒蛋白提取率理論值為12.62%。為方便實際操作，將提取工藝參數修正為NaOH濃度0.1 mol/L、液料比為7.5∶1（mL∶g）、提取時間140 min。在此條件下，實際測得的酵母富硒蛋白平均提取率實際值為12.58%，酵母富硒蛋白中硒含量為358.9 μg/g。與預測出來的理論值相接近，進一步驗證了模擬出來的數學回歸模型的準確性，得到的工藝參數與試驗所得的數值相差不大。

3 結論

采用Box-Behnken試驗設計原理，建立酵母富硒蛋白提取工藝參數的二次多項式數學模型，經檢驗該模型是合理可靠的，可以合理的預測提取酵母富硒蛋白的產率。提取富硒蛋白工藝參數對富硒蛋白的提取率有顯著影響，影響因子的主要順序為NaOH濃度＞提取時間＞液料比。酵母富硒蛋白提取優化工藝的參數為NaOH 0.1 mol/L、液料比為7.5∶1（mL∶g）、提取時間140 min，酵母富硒蛋白的提取率可達12.58%，酵母富硒蛋白中硒含量為358.9 μg/g。通過這種工藝技術，為以后富硒產品在食品添加劑，食品發酵等產業中提供一定的理論基礎。