5種漿果果酒抗氧化活性差異及綜合評價

許立偉，王炳宇，楊馨悅，薛桂新*

（延邊大學 農學院，吉林 延吉 133002）

藍莓（Blueberry）不僅含有脂肪、蛋白質、維生素和大量的微量元素[1-2]，還富含花青素[3]、糖苷、黃醇酮等活性成分[4]，具有防止腦神經老化、抗癌、軟化血管、增強機體自身免疫、清除自由基和體內有害物質等功能[5-6]。藍靛果學名為藍靛果忍冬（Lonicera caeruleaL.），富含花色苷、藍靛果多糖等成分[7]，具有抗腫瘤、抗氧化[8]、降低膽固醇含量、促進血液循環等功效[9]。不老莓學名為黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa（Michx.）Ell.），富含花青素、黃酮等多酚類物質[10]，具有一定的清除自由基能力[11]、對預防癌癥、心血管疾病、慢性炎癥等有一定的作用[12-13]。研究表明，將果實加工成果酒有利于保持原果實中的營養成分及功效活性[14]。

目前已有學者對藍莓果酒、藍靛果、黑果腺肋花楸果酒分別進行了營養成分和抗氧化活性的研究，陳亮等[15]研究了發酵期間藍莓果酒總酚含量、花色苷含量、自由基清除率以及還原力的變化并對其進行相關性分析。梁慧等[16]發現隨著發酵時間的延長，藍莓果酒的抗氧化能力逐漸減小。薛桂新[17]對陳釀期間不同藍莓添加量的藍靛果復合果酒的抗氧化能力的變化趨勢進行了研究，發現其抗氧化活性有所差異，且隨著陳釀時間的延長藍靛果藍莓復合果酒抗氧化能力下降。魏春雨等[18]研究了不同釀酒酵母對黑果腺肋花楸果酒成分的影響，結果表明，不同酵母菌發酵的黑果腺肋花楸果酒中香氣物質含量有所差異。然而鮮有關于這3種果酒在營養成分及抗氧化活性方面的差異性的研究報道。

本研究選用藍莓、藍靛果及不老莓發酵釀制成果酒，測定其理化指標、單體酚類物質含量、對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥基自由基（·OH）、2,2-連氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基、超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率，探究5種漿果果酒抗氧化活性的差異，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA）對其進行綜合評價。以期為藍莓、藍靛果、不老莓果酒的加工和開發提供技術依據，為更好地利用長白山地區漿果資源提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

野生藍莓（blueberry）、栽培藍莓（北陸）：長白山地區安圖縣；野生藍靛果（Lonicera caeruleaL.）、栽培藍靛果（蓓蕾）和不老莓（Aronia melanocarpa（Michx.）Ell.）：長白山地區汪清縣；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：意大利AEB公司。

1.1.2 試劑

維生素C、DPPH、無水乙醇、ABTS、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）aminomethane，THAM）、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸（tri-chloroaceticacid，TCA）、氯化鐵、苯酚、濃硫酸、福林試劑、無水碳酸鈉（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司；沒食子酸、（+）-兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品（純度均＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；果膠酶（酶活30 000 U/g）：和氏璧生物科技有限公司；纖維素酶（酶活10 000 U/g）：南寧東恒華道生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

BSA124S-CW電子分析天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；TDZ5-WS高速離心機：湖南湘儀實驗儀器有限公司；WY-055型手持糖度儀：長春市第四光學儀器廠；PHS-3C型酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；UV1101紫外分光光度計：上海新茂儀器有限公司；LC-2010A高效液相色譜儀：日本島津公司；C18Elipse Plus色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 漿果果酒工藝操作要點

操作要點：

漿果預處理、破碎打漿：選無腐爛、成熟度一致的果實，將果實破碎。

酶解、調整糖度：加入0.05%的果膠酶與0.1%纖維素酶在溫度25 ℃時酶解2 h，加入白砂糖，調整果漿糖度至21.5～22°Bx。

活化酵母：取果實質量0.02%的果酒釀酒酵母，按1∶20的比例加入38 ℃的溫水，放入38 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min。

主發酵：在25 ℃左右室溫發酵7～10 d，當酒精度為12%vol左右時，發酵結束，采用40目濾酒器過濾。

后發酵：將果酒酒液在室溫（25 ℃）發酵1個月。

常溫貯存：后發酵結束后在室溫（20～25 ℃）貯藏3個月即得漿果果酒，備用。

1.3.2 理化指標的測定

取2.0 mL果酒，用蒸餾水稀釋配制40 μL/mL的果酒稀釋液50 mL，穩定后放置，用于理化指標的測定，操作全程避光。

總糖含量的測定：參考劉志明等[19]的苯酚-硫酸法。

總酸含量的測定：參考楊宇馳等[20]的方法。

多酚含量的測定：采用Folin-Ciocalteu法[21]，以沒食子酸作為標準品進行定量。

總黃酮含量的測定：參考鄭嬌等[22]的方法，以蘆丁作為標準品進行定量。

總花色苷含量的測定：參考李安等[23]的方法。

1.3.3 單體酚類物質含量的測定

單體酚類物質含量的測定參照孫翔宇等[24]的方法，方法略有改動。取漿果果酒樣品25 mL于3 000 r/min離心10 min后，取上清液10 mL，以2倍體積的乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，35 ℃條件下減壓濃縮至干，以5 mL甲醇復溶，過0.22 μm濾膜后進樣分析。

色譜條件：采用C18Elipse Plus色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），配備紫外（ultra violet，UV）檢測器。采用二元梯度洗脫：流動相A為乙腈-冰乙酸（98∶2，V/V），流動相B為水-冰乙酸（98∶2，V/V）。洗脫程序為：0～60 min，A流動相5%～15%；60～65 min，A流動相15%；65～66 min，A流動相15%～20%；66～73 min，A流動相20%；73～74 min，A流動相20%～30%；74～80 min，A流動相30%；80～81 min，A流動相30%～40%；81～93 min，A流動相40%；93～98 min，A流動相40%～5%；98～103 min，A流動相5%。柱溫：30 ℃，流速：0.8 mL/min，進樣量：20 μL。

定性定量分析：根據各標準品的出峰時間定性，根據外標法定量。

1.3.4 抗氧化活性的測定

DPPH·清除率：參考MAU J L等[25]的方法進行測定。

ABTS+·清除率：參考LIU X Y等[26]的方法進行測定。

·OH清除率：參照程宏楨等[27]的方法并改動，改動如下：考慮到提取物本身具有顏色會產生一定的吸光度值，因此，以樣品水提液1mL、10mmol/LFeSO41mL和10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL 和1 mL蒸餾水測定的吸光度值作為本底值。

O2-·清除率：參照呂聞明[28]的方法并改動，改動如下：取樣品水提液0.2 mL，加入50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.2）5.6 mL，在25 ℃水浴中混合反應20 min，立即加入3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.2 mL。

還原力：參照烏日娜等[29]的方法進行測定。

1.3.5 數據處理

運用SPSS 25.0軟件對結果進行顯著性分析，對5種漿果果酒的抗氧化活性指標進行主成分分析，根據各主成分因子得分系數和方差貢獻率計算綜合得分[30]。

2 結果與分析

2.1 5種漿果果酒的理化指標對比

5種漿果果酒的理化指標測定結果見表1。

表1 5種漿果果酒的理化指標Table 1 Physical and chemical indexes of 5 kinds of berry wines

由表1可知，兩種藍莓果酒、兩種藍靛果果酒之間總糖含量不存在顯著性差異（P＞0.05），不老莓果酒總糖含量只與野生藍靛果果酒存在顯著性差異（P＜0.05），與其他樣品均不存在顯著性差異（P＞0.05）；5種漿果果酒的總酸、多酚、總黃酮、總花色苷含量均存在顯著性差異（P＜0.05）。其中野生藍靛果果酒的總糖、總酸、多酚、總黃酮、總花色苷含量最高，分別為1.55%、3.82%、9.69 mg/g、12.58 mg/g、1.21 mg/g，北陸藍莓果酒的總糖、總酸、多酚及總黃酮含量最低，分別為0.51%、0.99%、1.09 mg/g、2.38 mg/g、0.01 mg/g，不老莓果酒的總花色苷含量最低（0.01 mg/g）。

2.2 5種漿果果酒的單體酚類物質含量對比

由表2可知，5種漿果果酒中野生藍靛果果酒的咖啡酸、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、對香豆酸、蘆丁含量最高，分別為66.19 mg/g、878.09 mg/g、13.28 mg/g、735.50 mg/g、275.32mg/g、23.86mg/g，顯著高于其他果酒（P＜0.05）；野生藍莓果酒沒食子酸、阿魏酸、白藜蘆醇含量分別為21.94 mg/g、7.52 mg/g、52.68 mg/g，顯著高于其他果酒（P＜0.05）。5種漿果果酒10種單體酚類物質中兒茶素和綠原酸含量明顯高于單體酚類物質中其他物質（P＜0.05），且野生果實發酵的果酒單體酚類物質含量均高于人工種植果實發酵的果酒。在相同發酵條件下，5種果酒的化合物含量變化趨勢一致。因此，造成單體酚類物質中各成分含量有差異的原因在于果實本身所含成分。而野生果實發酵的果酒中單體酚類物質各成分含量高于人工種植果實發酵的果酒的原因可能與生長條件（土壤、光照等）有關，且在人工育種時，主要考慮人們對果實喜好的口感，導致一定的單體酚類物質成分損失。因此，綜合考慮，野生藍靛果果酒所含單體酚類物質含量更高。

表2 5種漿果果酒單體酚類物質含量Table 2 Contents of monomer phenols in 5 kinds of berry wines

2.3 5種漿果果酒的抗氧化活性對比

2.3.1 5種漿果果酒的DPPH·清除率

5種漿果果酒的DPPH·清除率見圖1。

圖1 5種漿果果酒DPPH·清除率的比較Fig.1 Comparison of DPPH·scavenging rate of 5 kinds of berry wines

由圖1可知，5種漿果果酒DPPH·清除率均存在顯著性差異（P＜0.05），按照DPPH·清除率的高低對不同果酒排序為：野生藍靛果果酒（92.29%）＞蓓蕾藍靛果果酒（81.64%）＞野生藍莓果酒（64.80%）＞不老莓果酒（44.36%）＞北陸藍莓果酒（20.51%）。這與漿果果酒多酚含量的結果一致。由于漿果果酒中含有多酚和黃酮類的抗氧化活性成分，對DPPH·具有一定的清除率，且多酚、黃酮含量高的漿果果酒對DPPH·清除率高[31]。因此，野生藍靛果果酒的DPPH·清除率最好。

2.3.2 5種漿果果酒的ABTS+·清除率

5種漿果果酒的ABTS+·清除率見圖2。

圖2 5種漿果果酒ABTS+·清除率的比較Fig.2 Comparison of ABTS+·scavenging rate of 5 kinds of berry wines

由圖2可知，野生藍靛果果酒（96.13%）與野生藍莓果果酒（96.77%）、不老莓果酒（96.05%）的ABTS+·清除率不存在顯著性差異（P＞0.05），均與其他果酒存在顯著性差異（P＜0.05），按照ABTS+·清除率的高低對不同果酒排序為：野生藍莓果酒（96.77%）＞野生藍靛果果酒（96.13%）＞蓓蕾藍靛果果酒（94.89%）＞不老莓果酒（96.05%）＞北陸藍莓果酒（84.63%）。有研究表明，酚類物質與抗氧化活性呈正相關[32]，由于漿果果酒中含有總花色苷以及豐富的酚類化合物，對果酒的ABTS+·清除率影響呈正相關。因此，野生藍靛果果酒、野生藍莓果果酒和不老莓果酒的ABTS+·的清除率最好。

2.3.3 5種漿果果酒的·OH清除率

5種漿果果酒對·OH清除率見圖3。

圖3 5種漿果果酒·OH清除率的比較Fig.3 Comparison of·OH scavenging rate of 5 kinds of berry wines

由圖3可知，野生藍靛果果酒的·OH清除率最好，與其他果酒存在顯著差異（P＜0.05）。野生藍莓果酒和蓓蕾藍靛果果酒·OH清除率不存在顯著性差異（P＞0.05），但與其他果酒存在顯著性差異（P＜0.05）。按照·OH清除率的高低對不同果酒排序為：野生藍靛果果酒（96.28%）＞蓓蕾藍靛果果酒（94.11%）＞野生藍莓果酒（93.39%）＞北陸藍莓果酒（39.98%）＞不老莓果酒（20.42%）。野生藍靛果果酒、野生藍莓果酒、蓓蕾藍靛果果酒的·OH清除率顯著高于北陸藍莓果酒和不老莓果酒。有研究表明，酚羥基可以與自由基反應生成較穩定的半羥基自由基，而漿果果酒中含有豐富的酚類物質，對·OH有一定的清除能力[33]。因此，野生藍靛果果酒的·OH清除率最好。

2.3.4 5種漿果果酒的O2-·清除率

5種漿果果酒的O2-·清除率見圖4。由圖4可知，5種漿果果酒中野生藍莓果酒的O2-·清除率最強，野生藍靛果果酒與不老莓果酒的O2-·清除率不存在顯著性差異（P＞0.05），但與其他三種果酒均存在顯著性差異（P＜0.05）。按照O2-·清除率的高低對果酒進行排序為：野生藍莓果酒（50.54%）＞不老莓果酒（33.45%）＞野生藍靛果果酒（33.27%）＞北陸藍莓果酒（32.19%）＞蓓蕾藍靛果果酒（25.18%）。漿果果酒中多酚類物質含量豐富，多酚是多羥基酚類衍生物的混合物，多以結合酚形式存在，黃酮類化合物具有共軛雙鍵結構，其易發生聚合、縮合、水解及氧化反應等，對O2-·有一定的清除能力[34]。因此，野生藍莓果酒的O2-·清除率最好。

圖4 5種漿果果酒O2-·清除率的比較Fig.4 Comparison of O2-·scavenging rate of 5 kinds of berry wines

2.3.5 5種漿果果酒的還原力

5種漿果果酒的還原力見圖5。由圖5可知，5種漿果果酒還原力均存在顯著性差異（P＜0.05），按照還原力大小對不同果酒進行排序為：野生藍靛果酒（1.744）＞蓓蕾藍靛果酒（0.975）＞野生藍莓果酒（0.817）＞不老莓果酒（0.469）＞北陸藍莓果酒（0.198），這與DPPH·清除率的趨勢一致。

圖5 5種漿果果酒的還原力的比較Fig.5 Comparison of the reducing power of 5 kinds of berry wines

對圖1～圖5進行綜合分析，5種漿果果酒的4種自由基的清除率和還原力表現出的抗氧化活性不同，其中野生藍靛果果酒抗氧化活性較強，北陸藍莓果酒抗氧化活性較弱；野生品種果酒的抗氧化活性顯著高于栽培品種（P＜0.05）。

2.4 5種漿果果酒的抗氧化活性主成分分析

抗氧化活性指標主成分分析載荷圖見圖6，特征值與累計貢獻率見表3，載荷矩陣見表4。

表3 漿果果酒抗氧化活性指標主成分的特征值與累計貢獻率Table 3 Characteristic value and cumulative contribution rate of the antioxidant activity evaluation factors of berry wines

表4 抗氧化活性指標主成分載荷矩陣Table 4 Principal component load factor of antioxidant activity indexes

由圖6可知，DPPH·、ABTS+·、·OH和還原力與O2-·有著明顯的區分，都存在著正相關的關系，這可能是因為漿果果酒中黃酮類化合物易發生聚合、縮合、水解及氧化反應等，對O2-·清除有一定的影響，導致漿果果酒對O2-·的清除能力與其他4種自由基有著一定的區別，即DPPH·、ABTS+·、·OH和還原力對5種漿果果酒抗氧化活性具有主要貢獻率。

圖6 抗氧化活性指標主成分分析載荷圖Fig.6 Main components loading diagram of antioxidant activity of 5 kinds of berry wines

由表3和表4可知，主成分1的特征值為3.190，方差貢獻率為63.81%，主成分2的特征值為1.092，方差貢獻率為21.83%，累計方差貢獻率為85.64%，保留了絕大多數的原始信息。以2個主成分代表原來5個抗氧化活性指標，建立不同樣品抗氧化活性的評價模型，得出以下抗氧化活性指標的線性關系式，

由公式（1）和表4可知，DPPH·、還原力、·OH、ABTS+·對5種漿果果酒抗氧化活性具有主要貢獻率。為能夠反映出5種不同果酒的抗氧化活性差異，以2個主成分的得分及權重構造抗氧化活性指標的評價函數F綜表達式見公式（3），得到的漿果果酒抗氧化活性綜合得分及排名見表5。

表5 5種漿果果酒抗氧化活性綜合得分及排名Table 5 Comprehensive score and rankings of 5 kinds of berry wines

由表5可知，野生藍莓果酒、野生藍靛果果酒和蓓蕾藍靛果果酒綜合得分較高且均為正數，抗氧化活性較好，分別排名1、2、3，不老莓果酒、北陸藍莓果酒綜合得分為負，抗氧化活性較低，分別排名4、5。

3 結論

5種漿果果酒中野生藍靛果果酒的總糖、總酸、多酚、黃酮、花色苷的含量最高，單體酚類物質中咖啡酸、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、對香豆酸、蘆丁含量最高。野生藍靛果果酒的DPPH·清除率（92.29%）、·OH清除率（96.28%）和還原力（1.744）最強；野生藍莓果酒的ABTS+·清除率（96.77%）和O2-·清除率（50.54%）最強；通過主成分分析建立抗氧化活性指標綜合評價模型，計算漿果果酒的綜合得分，對5種漿果果酒的抗氧化活性排序為：野生藍莓果酒＞野生藍靛果果酒＞蓓蕾藍靛果果酒＞不老莓果酒＞北陸藍莓果酒。該研究可為藍莓、藍靛果、不老莓果酒的加工和開發提供技術依據，為更好地利用長白山地區漿果資源提供技術指導。