基于HS-GC-IMS分析櫻桃酒中的揮發(fā)性風味物質(zhì)

劉寶祥，蘇政波 *，馬 闖，劉建軍

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院 山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室，山東 濟南 250013；2.哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院，黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

櫻桃的營養(yǎng)非常豐富、味道鮮美，富含糖、維生素、氨基酸、有機酸和礦物質(zhì)等成分[1-2]。此外，櫻桃中還含有類黃酮、抗壞血酸、酚類、花青素等營養(yǎng)健康成分[3-4]。我國種植櫻桃品種主要為甜櫻桃（Prunus aviumL.）、酸櫻桃（Prunus cerasusL.）、中國櫻桃（Prunus pseudocerasusL.）和毛櫻桃（Prunus tomentosaThunb），主要櫻桃產(chǎn)地為山東省、江蘇省和四川省[5]。由于櫻桃水分含量高，皮薄、肉軟，組織嬌嫩，采摘后不易儲存，導致櫻桃極易變味、變質(zhì)而失去價值[6]。隨著櫻桃產(chǎn)量的增加、人們對產(chǎn)品質(zhì)量要求的提高，開發(fā)櫻桃酒等高附加值、易儲存的產(chǎn)品成為一種趨勢。

風味是評價食品質(zhì)量的重要指標，也是櫻桃酒最重要的特征和品質(zhì)之一。櫻桃中的主要風味物質(zhì)為己烯醛、2-己烯-1-醇、乙醇、2-丙酮、乙醛、己醛、苯甲醛和苯甲醇[1]。經(jīng)過酵母菌發(fā)酵后，櫻桃酒的風味成分變得更為復雜。在櫻桃酒中，可以檢測到許多成分：如氨基酸、微量元素、有機酸、酚類和風味物質(zhì)等。風味物質(zhì)是評價食品質(zhì)量的基本感官指標之一，影響著最終產(chǎn)品的質(zhì)量。酒的風味受到原料、菌種、發(fā)酵工藝、熟化過程等多種因素的影響[5，7-9]。在過去的研究中，數(shù)千種風味物質(zhì)可以在果酒中被檢測到，但只有很少能夠達到氣味閾值并被聞到。NIU Y W等[10]通過固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）結合氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術，從櫻桃酒中檢出24種成分；結合氣相色譜-嗅聞技術（gas chromatography olfactometry，GC-O），確定了7種主要揮發(fā)性成分。SUN S Y等[11]利用頂空固相微萃取結合氣質(zhì)聯(lián)用，從櫻桃酒中檢出21種揮發(fā)性成分，包括6種酯類、2種醇類、6種萜類和1種酚類等。通過應用頂空固相微萃取（headspacesolid phase microextraction，HS-SPME）、氣相色譜（gas chromatography，GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、頂空-氣相色譜或氫火焰離子化檢測器（headspace-gas chromatography/flame ionization detector，HS-GC/FID）等技術手段，根據(jù)其所含的風味物質(zhì)成分，分析原料、菌種、發(fā)酵方式和熟化過程等對櫻桃酒品質(zhì)的影響，并評價其質(zhì)量[12-15]。

離子遷移譜（ion mobility spectrometry，IMS）是一種能夠單獨檢測氣體混合物的分析儀器，具有小巧、輕便、靈敏、所需樣品少的特點[16-17]。通過與氣相色譜聯(lián)用后，經(jīng)過氣相色譜柱的初次分離，隨后進入離子遷移管，待測分子在電離區(qū)帶電后，在電場和逆向漂移氣的作用下遷移到達檢測器檢測，實現(xiàn)二次分離。它結合了二者優(yōu)勢，無需預處理、分辨率較高，僅需3～5 min就可以完成樣品的檢測[18]。在食品分類和摻假檢測、食品新鮮度和腐壞度評價、異味檢測、食品加工過程監(jiān)測、食品貯藏等過程中香氣變化評價具有極大的優(yōu)勢[19]。本實驗以山東日照產(chǎn)新鮮櫻桃發(fā)酵而成櫻桃酒，通過頂空氣相色譜-離子遷移譜（HS-GC-IMS）研究櫻桃酒的揮發(fā)性風味成分，為理論研究和相關企業(yè)開發(fā)櫻桃產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

櫻桃：山東省日照市五蓮山“紅燈”櫻桃；白砂糖：市售。

果膠酶（酶活力1 000 U/g）：諾維信生物技術有限公司；果酒酵母：湖北安琪酵母有限公司；氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）；產(chǎn)品用水為純凈水。

1.2 儀器與設備

CTC CombiPAL自動頂空進樣器：瑞士CTC Analytics AG公司；FlavourSpec氣相離子遷移譜、食品風味分析與質(zhì)量控制系統(tǒng)（Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及GC×IMS Library Search Software定性軟件）：德國G.A.S公司；MJ-BL1052A料理機：廣東美的生活電器制造有限公司；L550低速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；HPX-200生化培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋：北京醫(yī)療設備廠；AE 200電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 櫻桃酒制作基本工藝與操作要點

新鮮櫻桃→揀選→清洗→除?！ズ恕驖{→酶解→加糖→接種酵母菌→發(fā)酵→去渣→澄清→櫻桃酒

操作要點：

取適量新鮮櫻桃，去除其中的壞果、腐爛果和其他雜物，選擇成熟度良好、顏色深的新鮮櫻桃；手工摘除櫻桃的果梗，再去掉櫻桃核，將處理好的櫻桃加入料理機，直接將櫻桃進行破碎、打漿；打漿好的櫻桃，加熱至50 ℃，加入一定量果膠酶，保溫并保持攪拌2 h；酶解過的櫻桃漿，加入15%白砂糖并溶解[20]，加入0.03%焦亞硫酸鈉，攪拌均勻，接種0.05%果酒酵母，于23 ℃條件下，保持靜置發(fā)酵7 d，至酒精度不再升高；發(fā)酵結束后使用離心機于4 000 r/min離心10 min，得到上層清液；經(jīng)檢測，酒精度為12.51%vol，還原糖含量9.7 g/L。

1.3.2 理化指標的測定

殘?zhí)橇康臏y定：按照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》執(zhí)行[21]；酒精度的測定：按照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》執(zhí)行[22]。

1.3.3 HS-GC-IMS分析條件

頂空孵育溫度：35 ℃；孵育時間：10 min；孵育轉(zhuǎn)速500 r/min；頂空進樣針溫度：40 ℃；進樣體積：100.0 μL；色譜柱：FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm，1 μm）；柱溫：60 ℃；IMS溫度：45 ℃；載氣：高純氮氣（N2）（純度≥99.999%）。

1.3.4 櫻桃酒中風味物質(zhì)的特征化合物的香氣特征測定

基于LAV軟件的GalleryPlot插件，確定櫻桃酒中揮發(fā)性有機物（volatile organic compounds，VOCs）圖譜，經(jīng)過美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)定性分析，得到揮發(fā)性化合物的定性數(shù)據(jù)和峰面積數(shù)據(jù)，結合文獻對化合物的描述[23-24]，確定櫻桃酒中風味物質(zhì)的特征化合物的香氣特征。

2 結果與分析

2.1 櫻桃酒風味物質(zhì)圖譜分析

櫻桃酒揮發(fā)性物質(zhì)的GC-IMS三維圖譜見圖1，坐標分別代表保留時間，遷移時間和峰強度，每個峰信號代表一種揮發(fā)性化合物，三維圖中可以直觀看出揮發(fā)性有機物。根據(jù)保留時間和遷移時間可以鑒定出揮發(fā)性化合物的種類，峰強度則可以比較化合物濃度的差別。

圖1 櫻桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)三維離子遷移譜Fig.1 Three-dimensional (3D)-ion mobility spectrometry of volatile compounds in cherry wine

櫻桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)二維圖譜見圖2，由圖2可以看出：櫻桃酒中的主要揮發(fā)性物質(zhì)在遷移時間0.8～1.8 ms，保留時間200～800 s的范圍內(nèi)。通過HS-GC-IMS在櫻桃酒中檢出38種物質(zhì)，對應鑒定出23種揮發(fā)性有機物。

圖2 櫻桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)二維離子遷移譜Fig.2 Two-dimensional (2D)-ion mobility spectrometry of volatile compounds in cherry wine

2.2 櫻桃酒中的風味物質(zhì)分析

通過HS-GC-IMS檢出的物質(zhì)和相關參數(shù)見表1，結果表明，櫻桃酒中共檢出23種揮發(fā)性化合物，其中酯類9種，分別為辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、異丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯和乙酸乙酯；醛類4種，分別為苯甲醛、糠醛、丙醛和戊醛；醇類5種，分別為己醇、3-甲基丁醇、丁醇、2-甲基丙醇和丙醇；酮類3種，分別為3-羥基-2-丁酮、4-甲基-2-戊酮和丙酮；此外，還有部分2,6-二甲基吡嗪和乙酸存在。

表1 GC-IMS檢測櫻桃酒中的揮發(fā)物參數(shù)Table 1 GC-IMS integration parameters of volatile compounds in cherry wine

續(xù)表

櫻桃酒的酯類成分尤為豐富，之前的報道中[12-14，25]，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸異丁酯為櫻桃酒中的主要揮發(fā)性化合物，異丁酸乙酯和乙酸丙酯的相對含量較低，其中丙酸乙酯和乙酸異丁酯未有在櫻桃酒檢測到的報道。醇類成分中，不考慮乙醇的存在，3-甲基丁醇、2-甲基丙醇和丙醇是櫻桃酒中的主要醇類風味物質(zhì)，主要在酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生，與先前的報道一致[13]，丁醇和己醇的相對含量較低。高級醇（包括丙醇、異丁醇、異戊醇和戊醇等）對酒類產(chǎn)品的風味有很大的影響，主要由釀酒酵母通過Ehrlich循環(huán)或糖酵解途徑水解支鏈氨基酸產(chǎn)生[26]。高級醇的產(chǎn)生和含量的高低受到很多因素的影響，包括發(fā)酵溫度、氨基酸濃度、發(fā)酵罐尺寸和陳釀條件等[27-28]。苯甲醛主要來自于櫻桃果實中[29]，糠醛和戊醛主要產(chǎn)生于酵母菌發(fā)酵過程中。此外，4-甲基-2-戊酮、2,6-二甲基吡嗪、3-羥基-2-丁酮和丙酮作為櫻桃酒中重要的風味成分，也有著重要的作用，同時風味物質(zhì)中還有少量乙酸的存在。

2.3 櫻桃酒揮發(fā)性成分離子峰圖譜分析

基于LAV軟件的Gallery Plot插件，櫻桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)的VOCs圖譜見圖3。

圖3 櫻桃酒中揮發(fā)性物質(zhì)Gallery Plot圖譜Fig.3 Gallery Plot of volatile compounds in cherry wine

由圖3可知，櫻桃酒中的揮發(fā)性成分含量較高主要為丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁醇、3-甲基丁醇、2-甲基丙醇、丙醇、3-羥基-2-丁酮、丙酮、4-甲基-2-戊酮和戊醛，這些成分為櫻桃酒的主要揮發(fā)性風味成分。從揮發(fā)性圖譜來看，2,6-二甲基吡嗪、異丁酸乙酯、乙酸、苯甲醛、糠醛、丙醛、丙醇和己醇的相對含量可能較低。

2.4 櫻桃酒風味物質(zhì)的香氣特征分析

櫻桃中香氣成分十分復雜，經(jīng)過發(fā)酵后帶來更為豐富的風味。櫻桃酒中風味物質(zhì)的特征化合物和香氣特征見表2，香氣類型分析圖見圖4。由表2和圖4可知，櫻桃酒中的揮發(fā)性物質(zhì)的香氣類型主要為水果香氣，包括7種果香（fruity）：己酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、異丁酸乙酯、丙酸乙酯和苯甲醛；3種柔和果香（ethereal）：乙酸丙酯、乙酸乙酯和2-甲基丙醇；此外，其他物質(zhì)也帶來青草（green）、白蘭地（waxy）、發(fā)酵（fermented）、烤面包（bready）、草本（herbal）、咖啡（coffee）、酒精（alcoholic）、黃油（buttery）、芳香氣味（solvent）、巧克力（chocolate）、酸味（acidic）等香氣，這些揮發(fā)性成分共同組成了櫻桃酒香氣的風味和特征。

表2 櫻桃酒中風味物質(zhì)的香氣成分及特征Table 2 Aroma components and characteristics of volatile compounds in cherry wine

圖4 櫻桃酒香氣類型分析圖Fig.4 Analysis diagram of aroma types of cherry wine

構成櫻桃酒風味成分的主要成分為酯類和醇類，酯類主要賦予櫻桃酒新鮮的水果香氣，乙醇和高級醇類賦予了櫻桃酒的酒精味道和其他復雜風味。香氣特征為水果香的物質(zhì)除了苯甲醛外，其他全部為酯類。苯甲醛主要來自于櫻桃果實中，酯類主要為乙酸酯和脂肪酸乙酯，主要產(chǎn)生于發(fā)酵中期，來自醇類和?；o酶A的縮合反應[30]。其他揮發(fā)性成分作為釀酒酵母的發(fā)酵產(chǎn)物，為櫻桃酒帶來青香、蠟香、咖啡味、巧克力和酸味等其他風味，使酒體的風味構成更為豐富。

3 結論

以新鮮櫻桃發(fā)酵生產(chǎn)櫻桃酒，通過HS-GC-IMS分析櫻桃酒的揮發(fā)性風味成分，獲得櫻桃酒的揮發(fā)性物質(zhì)圖譜。櫻桃酒中共檢出23種揮發(fā)性化合物，其中，酯類9種，醇類5種，醛類4種，酮類3種，吡嗪類1種和有機酸1種。結合櫻桃酒揮發(fā)性物質(zhì)圖譜和軟件分析，確定為辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、異丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸乙酯、苯甲醛、糠醛、丙醛、戊醛、己醇、3-甲基丁醇、丁醇、2-甲基丙醇、丙醇、3-羥基-2-丁酮、4-甲基-2-戊酮、丙酮、2,6-二甲基吡嗪和乙酸為櫻桃酒中的主要風味物質(zhì)。其中，僅有苯甲醛和丙醛在櫻桃中存在，其他大部分由釀酒酵母在櫻桃酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生。經(jīng)過櫻桃酒的香氣特征分析，櫻桃酒的香氣特征主要為果香和柔和果香，其他物質(zhì)也帶來青香、蠟香、發(fā)酵香、烤面包香氣、咖啡、酒精、黃油、芳香氣味、巧克力、酸味等香氣，這些揮發(fā)性成分共同組成了櫻桃酒的風味和特征。