白酒酒醅中真菌毒素的檢測

劉曉青，張 洪，申 劍，武 婷

（山西省科技資源與大型儀器開放共享中心，山西 太原 030006）

霉菌在侵染糧食谷物的過程中可產生各種真菌毒素，其種類很多，可達幾百種，同時化學性質比較穩定，是目前全球范圍普遍關注的一種食品有害物[1-3]。農作物中的霉菌污染無處不在，真菌毒素是霉菌的次生代謝產物，是霉菌生長所導致的一個重要結果[4-5]，真菌毒素可能產生于糧食生長、加工、貯藏等各個環節[6]，真菌毒素不僅有肝細胞毒性、生殖絮亂、中毒性腎損傷及免疫抑制等作用，還會致癌、致畸、致突變[7-8]。世界上多數國家都制定了嚴格的真菌毒素限量標準以保證食品及其相關制品的安全。

白酒是一種快速消費品，廣受國人的喜愛，其制作方式為將主要原料高粱，糖化發酵劑酒曲、酒母，經過粉碎、蒸煮、糖化、發酵蒸餾最后獲得。在白酒的生產制作過程中，來自于原料、酒曲及其生產環境的各種霉菌不僅產生酶、香氣和糖化淀粉，部分有害霉菌還會產生對人體有害的初級代謝產物或次級代謝產物，即真菌毒素[9]。

真菌毒素含量的檢測方法可分為兩大類，分別是快速檢測和確證檢測[10]?？焖贆z測方法有酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[11]、熒光定量試紙卡法[12]、適配體傳感器法[13]和膠體金試紙條法[14]等，這些方法檢測過程簡單、快速，但是有時會出現假陽性和假陰性，并且無法準確定量。確證檢測方法有液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）等，其中LC-MS/MS具有準確性好、分辨率高、靈敏度高、檢出限低等優點。李覓等[15]采用酶聯免疫吸附法對濃香型白酒生產過程中的各種樣品（大曲、酒醅、丟糟、黃水、基酒、成品酒）中的黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和桔霉素進行了定量分析。結果表明，黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A在大曲、酒醅、丟糟和黃水中都有檢出，在基酒和成品酒中的含量未達到檢出水平；桔霉素在6種樣品中均未檢出。葉光斌等[16]采用ELISA試劑盒法對瀘州老窖生產釀造過程中的大曲、酒醅、丟糟、黃水、基酒及成品酒中的赭曲霉毒素A的含量進行檢測，結果表明，大曲、酒醅、丟糟、黃水中均有檢出，但是含量遠低于國內外食品行業的限量標準，而基酒、成品酒中并未檢出。龐曉娜等[17]結合白酒產品工藝，分別采用酶聯免疫法和高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandemmass spectrography，HPLC-MS/MS）法對大曲及白酒生產中的酒醅、酒糟、基酒中進行了黃曲霉毒素B1的檢測，結果顯示，大曲、酒醅和酒糟中有黃曲霉毒素B1檢出，但是基酒中未檢出。韓現文[9]采用高效液相色譜（HPLC）法研究了蒸餾對酒醅中三種真菌毒素（黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）的影響，結果顯示，在蒸餾后的酒醅中檢出了這些真菌毒素，但在蒸餾酒中未檢出這三種真菌毒素。李曉頎等[18]建立了超高效液相色譜-串聯質譜測定白酒中黃曲霉毒素總量（G2、G1、B2、B1）的檢測方法，但是此研究只涉及到4種常見的真菌毒素。任璐等[19]在GB 5009.22—2016《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》方法1的基礎上進行了方法優化、改進，建立了釀酒原料及白酒中黃曲霉毒素B1的同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法。宮小明等[20]建立了葡萄酒中赭曲霉毒素A的實時直接分析-串聯質譜方法。汪瓊等[21]研究了液相色譜-質譜法測定啤酒中3種伏馬毒素的可行性。

上述研究涉及到的酒及酒的生產原料中的真菌毒素檢測種類較少，而實際生產中，以糧食作為原料的釀酒過程受到的真菌毒素污染種類眾多，本研究采用超高效液相色譜-串聯質譜建立白酒生產原料酒醅中31種真菌毒素的檢測方法，以期為白酒生產過程中真菌毒素的監測提供前處理簡單、檢測過程用時較短、結果準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品：某白酒企業，取10個批次。

31種真菌毒素標準品：壇墨質檢科技股份有限公司；乙腈、甲醇、乙酸銨和甲酸（色譜純）：美國Fisher公司；0.22 μm尼龍濾膜：天津博納艾杰爾公司。

1.2 儀器與設備

Acquity-Xevo TQ超高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜儀、Acquity UPLC BEH RPC18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Masslynx色譜質譜工作站：美國Waters公司；NEVAP-12氮吹濃縮儀：美國Organomation Associates有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；UMV-2多管渦旋混合器：北京優晟聯合科技有限公司；明澈-D24UV實驗室超純水系統：默克化工技術（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品溶液的制備

分別取31種適量真菌毒素標準品，用乙腈配制成質量濃度為100 mg/L的標準儲備液；分別取適量標準儲備液，用乙腈配制成質量濃度為1 mg/L的31種真菌毒素混合標準溶液；用乙腈稀釋，配制一系列混合標準工作液，質量濃度分別為1 μg/L、5 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、250 μg/L。

1.3.2 樣品前處理

樣品前處理使用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）法[22-24]。本研究參考趙英蓮等[25]的方法，除使用N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）粉外，還加入了石墨炭黑粉（graphitized carbon black，GCB）、十八烷基硅烷鍵合硅膠粉（C18）和硫酸鎂（MgSO4），通過改變4種試劑的用量配比，極大地改善了樣品凈化效果。

稱取粉碎并過50目分樣篩后的酒醅樣品約2 g，置于50 mL離心管中，將乙腈與1%的甲酸水以85∶15（V/V）混合，用于提取樣品中的真菌毒素。將樣品在20 mL提取溶劑中勻漿2 min，振搖20 min，于6 000 r/min離心10min，吸取上清液10 mL至離心管中，加入2 g QuEChERS法混合填料（45 mg GCB+225 mg PSA+450 mg C18+1 350 mg MgSO4），渦旋混勻5 min，于8 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL于40 ℃氮氣（N2）吹至約近干，加入體積分數20%的甲醇水溶液稀釋至1 mL，設置超聲波清洗機水溫為20 ℃，超聲功率為240 W，超聲振蕩5 min，過0.22 μm微孔濾膜，放入自動進樣器樣品瓶中進行后續的分析。

1.3.3 儀器條件

高效液相色譜：流動相A為0.1 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇溶液，流動相中均含0.1%甲酸；色譜柱Acquity UPLC BEH RPC18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；進樣體積10 μL；流速0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0～2.0 min，90%A；2.0～10.0 min，90%A～30%A；10.0～10.1min，30%A～10%A；10.1～12.0 min，10%A；12.0～12.1 min，10%A～90%A；12.1～15.0 min，90%A。

質譜：霉酚酸、交鏈孢酚單甲醚玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇采用電噴霧負離子（negative electrosprayionization，ESI-）模式，其他目標真菌毒素為電噴霧正離子（positive electrospray ionization，ESI+）模式；毛細管電壓：ESI+為3000V，ESI-為1500V；脫溶劑溫度450℃；離子源溫度150℃；脫溶劑氣N2，流速為900 L/h；錐孔氣（N2）流速為50 L/h；采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式檢測。

定性、定量：根據保留時間定性，采用外標法定量。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

流動相為50∶50（V/V）的甲醇和水（甲酸0.1%），流速為0.3 mL/min，將超高效液相色譜與質譜的連接模式調至為combine，將真菌毒素的標準物質溶液注入質譜。

2.1.1 優化母離子

關閉碰撞氣，進入MS-SCAN模式尋找母離子，正電離模式下加合方式為[M+H]+或[M+NH4]+，負電離模式下加合方式為[M-H]-。以5 V為步進手動優化錐孔電壓，使目標物的母離子響應值達到最高。

2.1.2 優化子離子

打開碰撞氣，進入MS/MS模式對母離子進行MRM子離子掃描，手動優化碰撞能量獲得子離子峰，選擇信噪比較高的兩個子離子分別作為定量和定性離子。31種真菌毒素的母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數見表1。

表1 31種真菌毒素的質譜條件參數Table 1 Mass spectrometry condition parameters of 31 mycotoxins

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2.2 標準工作曲線和檢出限、定量限

以目標化合物定量離子的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，建立了31種真菌毒素的標準工作曲線，以定性通道的3倍信噪比（S/N）確定化合物的檢出限（limit of detection，LOD），以定量通道的10倍信噪比（S/N）確定化合物的定量限（limit of quantitation，LOQ），結果見表2。由表2可知，31種真菌毒素的線性關系良好，相關系數（R2）在0.991～0.999之間。檢出限和定量限分別為0.10～5.00 μg/kg和0.4～16.5 μg/kg。

表2 31種真菌毒素的標準工作曲線、相關系數、檢出限和定量限Table 2 Standard working curves,correlation coefficients,detection and quantitation limits of 31 mycotoxins

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2.3 回收率和精密度實驗

取酒醅空白樣品，做4個質量濃度的加標回收試驗，濃度分別為方法定量限及定量限5倍、10倍和25倍，每個濃度做5個平行，平均回收率和相對標準偏差見表3。由表3可知，真菌毒素在4個添加質量濃度下的平均回收率為83.1%～108.7%，回收率實驗結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在2.5%～9.6%之間。

表3 31種真菌毒素的回收率Table 3 Recovery rates deviations of 31 mycotoxins

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2.4 樣品測定

利用所建方法對10個酒醅樣品進行檢測，測定結果見表4。其中糧食中常見的黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其衍生物、玉米赤霉毒素、赭曲霉毒素均有檢出，而伏馬毒素、桔青霉素、霉酚酸、青霉酸、渥曼青霉素、交鏈孢酚、交鏈孢酚單甲醚、麥角胺等在樣品中未檢出。編號為4、7、9、10的樣品無一種真菌毒素檢出，編號為1、5、6、8的樣品有1～2種真菌毒素檢出，而2號和3號樣品中分別檢出5種、6種真菌毒素。

表4 酒醅樣品中真菌毒素的檢測結果Table 4 Detection results of mycotoxins in fermented grains samples

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3 結論

本研究建立了白酒生產原料中31種真菌毒素含量的LC-MS/MS法，其檢測范圍覆蓋了常見的糧食作物中的真菌毒素及其相關代謝產物。本方法采用外標法定量，相關系數R2在0.991～0.999之間，標準曲線線性關系良好；平均回收率為83.1%～108.7%，回收率實驗結果的RSD為2.5%～9.6%；檢出限為0.1～5.0 μg/kg；定量限為0.4～16.5 μg/kg，可滿足白酒生產過程中原料的檢測要求。

本研究對隨機采樣的10個酒醅樣品進行了31種真菌毒素檢測。其結果表明同一樣品會受到不同種類霉菌的侵染，從而檢出多種真菌毒素，同時在糧食污染中常見的真菌毒素，例如：黃曲霉毒素、玉米赤霉毒素、赭曲霉毒素在酒醅中存在。本研究檢測真菌毒素的范圍更廣，種類更多，發現除去常見的真菌毒素，還有T-2毒素、雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙?；撗跹└牭毒┐肌?5-乙?；撗跹└牭毒┐肌㈦s色曲霉素等毒素的檢出，而關于31種真菌毒素是否會從酒醅中遷移至白酒中還有待進一步研究。