發酵時間對清香型白酒二茬基酒風味物質組成及含量的影響

胡雨楠，張鐘曉，陳小雪，薛巖松，韓北忠*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院農業農村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083；2.山西旭泰北方釀酒有限公司，山西忻州 034300）

白酒是世界六大蒸餾酒之一，憑借其獨特的風味和口感廣受消費者的喜愛[1]。影響白酒風味形成的因素眾多，例如，釀造加工過程中產生的內源性風味物質和風味物質之間的相互作用等[2]。清香型白酒歷史悠久、風味獨特，其主體香以乙酸乙酯為主，輔以適當的乳酸乙酯[3]，其風味物質組成包括酯類、醇類、酸類、醛酮類、烴類、苯及其衍生物類等。通常清香型白酒二茬基酒傳統固態發酵時間一般為21～28 d[4]。在發酵后期，由于發酵過程中微生物持續代謝以及物質之間相互作用，基酒中各種物質不斷積累，對基酒在發酵后期的風味特征產生影響[2]。因此延長固態發酵時間，可能會對基酒品質產生影響。但目前尚無研究探討延長發酵時間對清香型白酒風味物質形成的影響。

氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術可用于分析復雜樣品中揮發性風味物質的組成及含量，目前采用該技術對酒類風味的研究需要匹配合適的樣品前處理技術，主要方法包括直接進樣法、液液萃取法、攪拌棒固相微萃取法和頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase micro extraction，HS-SPME）等[5-7]。與其他萃取技術相比，HS-SPME萃取時間短，并且可以高效準確的對樣品中各類揮發性和半揮發性物質進行分析[8]，因此被廣泛用于發酵食品特別是白酒風味特性的識別和定量。FANG C等[9]借助HS-SPME-GC-MS對比了中國白酒和西方蒸餾酒的風味差異，從中重點鑒定并分析了二者間主要的差異風味物質[9]。DING X等[10]通過HS-SPME-GC-MS和微生物分析方法，探究了酒醅和白酒中揮發性物質在釀造過程中的互作與動態遷移，闡明了風味物質形成的潛在機制。熒光分析法具有很高的靈敏度和不破壞樣品結構等優點，非常適合于多組分混合物的定性分析。采用三維熒光光譜（three-dimensional fluorescence spectroscopy，3D-FS）分析可以直觀地觀察到白酒中特征風味物質的熒光峰位置和強度，并且可以提供比普通二維熒光光譜和同步熒光光譜更完整的光譜信息[11]。目前已有研究將三維熒光光譜運用于白酒風味的研究中，主要包括對白酒年份的鑒定[12]和對白酒中乙醇與水締合機理的探究[13]。借助三維熒光光譜對白酒風味組成進行研究，可為理解白酒復雜體系中物質的相互作用機理提供重要的理論依據，對探究白酒發酵時間對基酒品質的影響提供理論基礎，并且為評價白酒品質提出創新角度。

目前，三維熒光技術應用于清香型白酒物質研究相對較少，通過熒光光譜直接對白酒復雜體系物質研究有較大難度。本研究通過頂空固相微萃取氣相色譜-質譜聯用（HS-SPME-GC-MS）技術測定了不同發酵時間清香型白酒基酒的風味物質輪廓，并將HS-SPME-GC-MS與三維熒光光譜技術結合，探究不同發酵時間清香型白酒二茬基酒中揮發性風味物質含量與其熒光光譜的關聯，對全面認識和理解發酵時間對于清香型白酒的風味組分的物質基礎和風味特征具有重要價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香型白酒基酒樣品：山西某釀酒有限公司。

4-甲基-2-戊醇（色譜純）、C6～C30正構烷烴標準品（色譜純）：美國Sigma公司；NaCl（分析純）：上海國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C氣質聯用儀、HP-FFAP色譜柱（50 m×20 μm×0.33 μm）：美國安捷倫公司；FS5型熒光分光光度計：英國愛丁堡儀器公司；KQ3200DE型數控超聲波清洗儀：昆山超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 取樣

分別取清香型白酒二茬固態發酵第24、28、31和35天的基酒樣品（分別編號為BL-24、BL-28、BL-31、BL-35），使用超純水調節樣品酒精度至65%vol進行揮發性風味物質檢測，調節樣品酒精度至60%vol進行感官評價。所有樣品均密封保存于4 ℃待測。

1.3.2 清香型原酒揮發性組分檢測

樣品制備：取2.5 mL基酒樣品加入裝有3 g NaCl的20 mL頂空樣品瓶中，隨后快速加入2.5 mL超純水和10 μL 4-甲基-2-戊醇（9.12 mg/L）作為內標。自動萃取流程：充入高純氮氣（N2），將已經過解吸的SPME萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，萃取頭距離液面1 cm，置于恒溫磁力攪拌平臺上于50 ℃萃取45 min，達到平衡后，取下SPME萃取頭，立即插入GC-MS進樣口，250 ℃熱解吸5 min。

色譜條件：進樣口溫度250 ℃，流速1 mL/min；升溫程序：50 ℃保持2 min，再以2 ℃/min的速度升溫至85 ℃保持1 min，再以5 ℃/min的速度升溫至230 ℃保持2 min。

質譜條件：電子離子（electron ionization，EI）源，離子源溫度230 ℃，MS四級桿溫度150 ℃，電子能量70 eV；利用質譜全離子掃描圖譜，質量掃描范圍為20～350 amu。

定性及定量分析：利用Agilent Masshunter Qualitative Analysis 10依據美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）17標準譜庫對揮發性風味物質進行定性分析。利用內標峰面積對揮發性物質進行定量計算。根據在相同色譜條件下正構烷烴（C6～C30）的線性保留時間（retention time，RT）計算物質保留指數（retention index，RI）值。

1.3.3 三維熒光光譜測定

使用愛丁堡FS5型熒光分光光度計進行測定。每次取1 mL基酒樣品于四通石英比色皿中，使用氙燈，激發波長（excitation wavelength，EXWL）范圍為250～600 nm，步長5 nm；發射波長（emission wavelength，EMWL）范圍為280～800 nm，步長1 nm。狹縫寬度為5 nm，積分時間為0.1 s。

1.3.4 感官評價

依據國標GB/T 33405—2016《白酒感官品評術語》對基酒樣品中的色澤、澄清度、酯香、醇香、青草香、酸味、苦味、甜味、協調性、豐滿度、持久度共11個指標進行品評。品評人員由18名受過訓練的專業人員組成，隨機分為六組。每種基酒樣品各取20 mL呈遞給品評員，對以上指標進行0～5分打分，每個指標滿分為5分。其中0分表示指標屬性不符合、無明顯感覺，5分表示指標屬性相對明顯、突出。

1.3.5 數據分析

利用SIMCA 14.0（Umetrics，MKS Data Analytics Solutions）對GC-MS定量結果進行偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）及聚類分析（cluster analysis，CA）。利用R v4.0.2進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和Duncan檢驗計算樣品間的顯著性（P＜0.05）。物質香氣描述參考http：//www.flavornet.org/。利用Origin 8.5和R v4.0.2進行數據處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 不同發酵時間所產清香型白酒基酒揮發性風味物質組成及含量解析

通過SPME-GC-MS測定了不同發酵時間（第24、28、31和35天）清香型白酒基酒揮發性風味物質組成及含量，其總離子流色譜圖見圖1，揮發性風味物質含量測定結果見表1。由圖1及表1可知，4個基酒樣品中共鑒定出52種揮發性風味物質，其中，酯類物質26種、苯及其衍生物12種、烴類5種、醇類4種、醛酮類4種、酸類1種。除乙醇外，含量較高的揮發性風味物質（質量濃度＞100 mg/L）有十六酸乙酯[（641.64±53.1）～（823.26±27.49）mg/L]、月桂酸乙酯[（246.46±12.94）～（361.84±34.70）mg/L]、乙酸乙酯[（253.18±20.1）～（320.00±64.73）mg/L]、十四酸乙酯[（182.37±17.1）～（273.36±34.25）mg/L]、癸酸乙酯[（143.48±9.81）～（374.53±48.06）mg/L]、異戊醇[（143.94±20.18）～（169.00±7.01）mg/L]，這些物質與清香型白酒中主要風味物質種類基本一致[4，6，14]。清香型白酒典型風味特點是乙酸乙酯為主和適量的乳酸乙酯。通過定量分析表明，發酵第24、28、31和35天的基酒樣品中，乙酸乙酯和乳酸乙酯的比例分別為6.4、9.7、9.3和8.2，表明隨著發酵進行至28 d，乙酸乙酯的比例顯著升高，繼續延長發酵至35 d，乙酸乙酯比例有少量下降但一直保持在較高水平。

圖1 四個基酒中揮發性風味物質HS-SPME-GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile flavor compounds in four kinds of base liquor analysis by HS-SPME-GC-MS

表1 四個基酒中揮發性風味成分HS-SPME-GC-MS分析結果Table 1 Results of volatile flavor components in four kinds of base liquor analysis by HS-SPME-GC-MS

續表

2.2 發酵時間對基酒風味的影響

在范氏圖中，主要化合物如酯類、酸類等聚集在特定的區域內，基于此可判斷樣品中物質的多樣性變化以及反映化合物結構的變化趨勢[23]。通過計算O/C和H/C比例，以H/C原子比為縱坐標，O/C原子比為橫坐標繪制范氏圖，結果見圖2。存在于O/C＜0.3 H/C=2信號區域中的物質主要為酯類物質[23]。由圖2可知，四個基酒樣品在該區域均具有較大信號強度，說明在清香型白酒釀造過程中，以十六酸乙酯、十五酸乙酯、十四酸乙酯、癸酸乙酯為主的各種酯類物質對風味起到重要作用，并且含量較高。隨著發酵時間延長至35 d，該區域信號強度明顯增強。在O/C=0.5、H/C=2的信號位置，具有較大信號強度的物質是乙酸乙酯，也是清香型白酒中主要的風味物質。這些酯類物質主要來自于白酒發酵過程中的產酸階段，隨著乙醇在前期積累到一定程度，乳酸菌等微生物成為發酵體系中優勢菌群，由乳酸菌代謝直接產生的酸類物質與醇類物質相互作用，發生酯化反應，從而生成各種酯類風味化合物[24-25]。范氏圖中另外一個重要區域在O/C=1、H/C=2位置，被認為主要為碳水化合物和酸類物質[23]，由于白酒樣品中不存在碳水化合物，因此該區域反應了酸類物質的變化。乙酸等酸類物質具有刺鼻的蠟味香氣[16]，對基酒風味有重要貢獻。發酵24 d時乙酸質量濃度為4.93 mg/L，隨著發酵時間延長至35 d，基酒中乙酸在白酒中質量濃度降低為0.04 mg/L。并且由于乙酸在發酵后期與乙醇相互作用，對乙酸乙酯含量升高有一定影響。

圖2 發酵第24天（A），28天（B），31天（C）及35天（D）的基酒樣品范氏圖分析結果Fig.2 Results of Van Krevelen plot of four kinds of base liquor of fermentation 24 d (A),28 d (B),31 d (C),and 35 d (D)

范氏圖可以進一步反映基酒樣品中物質結構的變化[23]。由圖2可知，隨著發酵時間延長，低O/C（＜0.2）的物質逐漸增多，即基酒樣品中極性官能團的含量（羰基、酚羥基等）逐漸增多。另外，與發酵24 d基酒樣品相比，第28～35天基酒樣品中O/C=0區域信號強度有所增加，表明烴類物質逐漸積累，豐富了基酒風味特征。

2.3 不同發酵時間清香型白酒基酒揮發性風味物質差異分析

對解析出的清香型白酒基酒揮發性風味物質進行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）及聚類分析（CA），結果見圖3。由圖3A可知，每種基酒樣品內聚類效果較好，說明樣品重復性良好，結果具有較高可信度。由圖3B可知，第24天基酒樣品與其余三個樣品在第一變量上具有較大差異，說明發酵到第28天以后，揮發性風味物質種類和含量逐漸趨于穩定。

圖3 基于四個基酒樣品中揮發性物質的偏最小二乘法判別分析（A）和聚類分析（B）Fig.3 Partial least squares discrimination analysis (A) and clustering analysis (B) based on volatile compound of four kinds of base liquor

為了能更直觀地說明不同發酵時間所產基酒樣品中風味輪廓的相似性和差異性，對四個基酒樣品中的52種風味物質進行了韋恩圖和Upset圖的構建，結果見圖4。由圖4和表1可知，四種基酒樣品中共有風味物質35種，主要包括十六酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯、十四酸乙酯、異戊醇、9-十六碳稀酸乙酯、十五酸乙酯、乳酸乙酯、己酸異戊酯、正己酸乙酯、異丁醇和4-甲基愈創木酚等清香型白酒中的主要風味物質[6，14]。由于基酒樣品沒有進行陳釀和勾調，因此主要風味物質含量與成品清香型白酒有一定差異，但是高豐度物質種類基本一致[26]。酯類物質在塑造清香型白酒風格和風味物質組成中占據主導地位[1-2]，酯類香氣化合物的含量遠高于其他類型香氣化合物的含量，并且隨著發酵時間延長，酯類物質含量逐漸上升，賦予基酒水果香、花香、堅果香等風味特點。芳香族化合物在酒體中具有甜香、果香的特點，香味突出且閾值較低[26-27]。發酵延長至28 d時，1,2-二甲基萘、甲基苯甲醇、2-甲基萘等物質生成，使基酒風味更加豐富。此外，隨著發酵時間延長至28 d，白酒中具有相關功能的物質逐漸產生并積累，比如植酮、甲基苯甲醇、Δ-杜松烯、癸酸3-甲基丁酯、A-二去氫菖蒲烯等物質，其中植酮被證實具有一定抗癌能力[28]，Δ-杜松烯被證實具有體外抗腫瘤細胞的活性[29]。以上物質均被認定為是白酒或其他蒸餾酒中的香氣成分[9]。

圖4 不同發酵時間的基酒樣品中揮發性物質的關系Fig.4 Relationship of volatile components between base liquor of different fermentation time

2.4 不同發酵時間所產清香型白酒基酒樣品的三維熒光光譜特征

對四個基酒樣品進行三維熒光測定，并繪制等角三維投影圖，結果見圖5。由圖5可知，四個基酒樣品均在EX/EM=370 nm/435 nm和EX/EM=280 nm/315 nm處有明顯的吸收峰，并且除熒光強度外，光譜特征基本一致。不同發酵時間下的熒光峰強度見圖6。由圖6可知，與上述風味物質分析結果相同，發酵第24天基酒樣品與其他樣品具有較大區別，并且第28天后熒光峰強度趨于穩定。由于所含風味物質差異越大，光譜形狀差異越大。因此三維熒光光譜的特征與基酒樣品中風味物質含量和成分有密切關系。通過三維熒光光譜，可以利用峰位置對所記錄的物質信息進行判斷。

圖5 發酵第24天（A）、28天（B）、31天（C）及35天（D）基酒的三維熒光光譜圖Fig.5 Three-dimensional fluorescence spectroscopy of base liquor of fermentation 24 d (A),28 d (B),31 d (C) and 35 d (D)

圖6 發酵第24天、28天、31天及35天基酒的熒光峰強度Fig.6 Fluorescence intensity of base liquor of fermentation 24 d,28 d,31 d and 35 d

由于樣品使用的基酒主要物質為乙醇，而EX/EM=280nm/315 nm處的吸收峰與喬華等[13]報道的乙醇-水團簇熒光峰位置相近。同樣地，醇類物質被認為在激發波長為250 nm到300 nm附近有吸收峰[30]，在本研究中的四個基酒樣品中，除乙醇外，2-乙基己醇、異丁醇、苯乙醇等高級醇含量均隨著發酵時間延長而顯著性降低，與熒光峰強度變化趨勢相同。因此可以推斷醇類物質在三維熒光光譜EX/EM=280nm/315 nm處與峰特征的形成有關。高級醇是引起酒后“上頭”的主要成分，并且過量服用會影響人體健康[31]。也有研究表明，在激發波長270 nm附近，是糠醛等物質的產生，導致吸收峰強度的變化[32]。但由于通過GC-MS鑒定出基酒樣品中糠醛含量較低（2.59～4.00 mg/L），并且變化不顯著，因此可以排除糠醛的產生對峰強度的影響。

酯類、醛類、酸類物質官能團中的-C=O為熒光發射基團，產生π—π*電子躍遷，具有氧化性。在370 nm/435 nm位置發現的吸收峰，同樣在起泡酒中發現，并認為與還原型輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）等具有氧化性的物質有關[33]。本研究中四種基酒樣品均具有較高濃度的酯類化合物，以及一定濃度的醛類和酸類化合物，因此在370 nm/435 nm位置具有吸收峰?；贕C-MS測定結果分析，基酒樣品中含量較高的物質為十六酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯和乙酸乙酯，占全部風味物質濃度的66%，并且樣品中物質濃度變化也與370 nm/435 nm位置處的峰強度變化趨勢相同。因此可以推斷酯類對于清香型白酒三維熒光光譜特征形成有重要影響。

2.5 不同發酵時間清香型白酒基酒樣品的感官評價分析

綜合18名品評人員對不同發酵時間清香型白酒基酒樣品的感官評價分析結果見圖7。

圖7 發酵第24天、28天、31天及35天基酒樣品感官評價結果Fig.7 Sensory evaluation results of base liquor of fermentation 24 d,28 d,31 d and 35 d

由圖7可知，四個基酒樣品中色澤和澄清度沒有明顯區別。其他感官特性結果均表明，28 d與24 d有明顯區別，28～35 d基酒樣品沒有明顯區別，該結果與上述GC-MS和三維熒光光譜分析結果一致。從整體基酒感官結果分析，24 d酒樣的豐滿度、協調性、持久性較差，而延長發酵至28 d后，對于基酒樣品整體感官有明顯提升。伴隨酯香類物質如乙酸乙酯、十六酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯等物質含量隨著發酵延長至28 d后逐漸升高，酯香類感官評價得分也明顯升高。發酵第24天的基酒樣品苦味和酸味相對較重，與24 d基酒樣品中檢測出的較高含量的乙酸以及豐富的雜味物質有關。結果表明，相較于發酵24 d的基酒，延長發酵至28 d會對基酒感官品質和風味物質產生與積累有積極影響。

3 結論

傳統清香型白酒固態發酵時間通常為24 d，基于此，本研究通過延長發酵時間至35 d，并探究基酒中風味物質的組成及含量，闡明了不同發酵時間所產清香型白酒基酒樣品中風味物質輪廓的差異。十六酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯、十四酸乙酯、異戊醇是二茬基酒中含量較高的風味物質，共同構成了清香型白酒二茬基酒的主要風味特征?；茦悠分懈呒壌嫉纫住吧项^”物質在延長發酵時間后含量降低，主要呈香的酯類物質隨發酵時間延長而增加。該結果與三維熒光光譜在波長280 nm/315 nm處和370 nm/435 nm處的峰強度變化趨勢相同。通過探究延長發酵時間對清香型白酒三維熒光光譜特征與風味物質輪廓的影響，并對清香型白酒的關鍵風味物質和本質特征的分析，對提升清香型白酒品質及質量穩定性具有重要價值。進一步研究需深入探究延長發酵時間對特征風味物質形成和累積的潛在機制，并探索采用三維熒光光譜實現白酒快速檢測的實踐可行性。