基于Illumina MiSeq高通量測序技術分析5種不同臭豆腐生坯細菌多樣性

鄧高文，蔣立文，2，劉 洋，2*

（1.湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

臭豆腐是中國傳統的地方特色輕度發酵豆制品，歷史悠久，“聞起來臭，吃起來香”是臭豆腐的顯著特點。中國臭豆腐種類繁多，其中湖南長沙臭豆腐因其“黑如墨、香如醇、嫩如酥、軟如絨”的特點而深受廣大消費者喜愛。各地臭豆腐從原料和制作工藝都有所不同，而制作長沙臭豆腐需先制作臭鹵水，再將制作好白豆腐浸泡進行輕度發酵，以獲得含獨特“臭味”的臭豆腐坯，再在低溫冷鏈條件下運輸到加工門面進行油炸食用。臭鹵水是用豆豉、香菇、莧菜、竹筍和香辛料等植物為原料加水混合自然發酵數月至3年不等，使其具有特異的植物發酵液風味[1-5]。微生物在臭豆腐特殊風味的形成過程中起到至關重要的作用：臭豆腐鹵水中原料的蛋白質被微生物分解為多肽及氨基酸，且釋放出吲哚、苯酚等特殊風味的物質，油炸后揮發，從而形成了臭豆腐的特殊風味[6-8]。谷靜思等[9]通過對臭豆腐高通量測序分析，共發現212種細菌，其中66種屬于乳酸菌。賀靜等[10]通過454高通量技術對臭豆腐鹵水微生物多樣性進行分析，發現不同樣品優勢菌種差異較大，說明鹵水來源不同對微生物的差異顯著。趙國忠等[11]通過傳統微生物鑒定和16SrRNA對臭豆腐鹵水微生物進行分析，分離鑒定出漫游球菌（Vagococcus carniphilus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、沙克乳桿菌（Lactobacillus sakei）、地衣芽孢桿菌（Enterococcus avium）、鳥腸球菌（Enterococcus devriesei）等細菌。譚金萍[12]則從鹵水中分離與臭豆腐鹵水風味成分密切相關的微生物環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和解硫胺素解硫胺素桿菌（Bacillus aneurinolyticus）。

目前對于臭豆腐的微生物研究大多集中在臭豆腐鹵水，由于臭豆腐一般在企業生產半成品—臭豆腐生坯進行真空包裝后再輸送到連鎖店進行油炸食用和產品推廣，但因產品水分含量高，物流過程中冷鏈輸送特別是高溫季節稍有不慎就會出現產氣漲包，影響產品質量甚至安全[6]。本實驗以5個不同廠家的臭豆腐生坯為研究對象，通過高通量測序技術分析臭豆腐生坯中細菌多樣性，并對其進行主成分分析（principal component analysis，PCA），探索出5種不同廠家臭豆腐生坯之間微生物多樣性特點，為預防和控制半成品脹氣提供重要參考，為產業鏈安全和質量保證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

臭豆腐生坯（編號為YYD1、HSJD2、CGL3、PJX4、JXF5）：來自5個不同生產企業用于流通領域的低溫保存半成品（0～8 ℃）。

1.1.2 化學試劑

氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；酚酞溶液Phusion熱啟動Flex 2X預混液：上海儀濤生物儀器有限公司；DL2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：日本Takara公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit：美國英杰生命技術有限公司；瓊脂糖G-10：法國Biowest公司；50×TAE 緩沖液：上海生工生物工程股份有限公司；AxyPre聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：美國愛思進公司；RStool DNA試劑盒：美國Omega公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-50 KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1FD無菌操作臺：蘇州凈化設備有限公司；LRH-250生化培養箱：上海飛越實驗儀器有限公司；S1000 PCR儀：美國BIO-RAD公司；MiSeq測序儀：美國Illumina公司；EPS 300型電泳儀、Tanon-2500型凝膠成像儀：上海天能公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 臭豆腐生坯樣品基本指標測定

水分含量：按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》；菌落總數：按照GB 4789.2—2016《菌落總數測定》；大腸菌群：按照GB 4789.3—2016《大腸菌群計數》。

1.3.2 臭豆腐生坯樣品總DNA的提取

將臭豆腐生坯（YYD1、HSJD2、CGL3、PJX4、JXF5）與水按照質量比1∶9攪拌均勻后各取50 g，然后用孔徑為0.22μm的水系微孔濾膜進行抽濾[13]。將抽濾完成后的濾膜剪碎放入微型離心管中，按照R Stool DNA試劑盒說明書提取總DNA。

1.3.3 臭豆腐生坯16S rDNA高通量測序方法

以臭豆腐生坯總DNA為模板進行細菌16S rDNA V3-V4區域擴增。引物：338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）；806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。

PCR擴增體系：DNA模板50 ng、上下游引物各為2.5 μL、12.5 μL PCR預混合物、雙蒸水25 μL。

PCR擴增條件：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環35次；最后72 ℃延伸10 min。

取PCR產物10 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將檢測合格樣品送至杭州聯川生物技術有限公司進行高通量測序[14-15]。

1.3.4 數據分析

純化后的樣品由杭州聯川生物有限公司進行上機測序。為了保證后續結果的可靠性，使用Vsearch（V2.3.4）軟件過濾去除長度＜100 bp的序列、含不確定堿基達5%以上的序列及嵌合體序列等低質量序列。再以平均鄰近聚類算法通過Verseach（V2.3.4）將具有97%以上相似性的序列劃分為同一個操作分類單（operational taxonomic units，OTU），挑選代表性序列使用[16-17]。在核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）中進行序列比對，明確序列的分類地位。通過Alpha和Beta多樣性分析研究單個樣本中物種的多樣性和多個樣本間菌群結構的差異。對樣品進行PCA，并基于16S rRNA基因擴因子測序結果作圖。

1.3.5 數據處理

采用Origin 8.0、SPSS 18.0和Excel 2019進行數理統計分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 5種臭豆腐生坯樣品基本指標測定結果

由表1可知，不同廠家臭豆腐生坯的水分、菌落總數和大腸菌群存在一定差異，這可能是加工工藝不同所導致的。在5種臭豆腐生坯中，樣品PJX4水分含量、菌落總數、大腸菌群均最高，分別為84.73%、1.21×103CFU/g、29×10-2CFU/g；樣品HSJD2水分含量、菌落總數、大腸菌群均最低，分別為80.50%、1.05×103CFU/g、22×10-2CFU/g。可能是水分含量與菌落總數和大腸菌群呈正相關。

表1 5種臭豆腐生坯樣品基本指標檢測結果Table 1 Determination results of basic indexes of 5 kinds of stinky tofu Shengpei samples

2.2 5種臭豆腐生坯樣品測序數據統計分析

通過IlluminaMiSeq測序后5個樣品共產生了1 676 294條有效數據（Valid Tags），本次測序有效數據統計結果見表2。

由表2可知，5種臭豆腐生坯樣品中共得到342 560個有效的序列數（Tags）。5種樣品中堿基質量值（Q＞20%和Q＞30%）的數據均在90%以上，表明此次測序數據較好，可進行后續數據分析。

表2 5種臭豆腐生坯樣品測序有效數據統計Table 2 Sequencing valid data statistics of 5 kinds of stinky tofu Shengpei samples

2.3 5種臭豆腐生坯樣品Alpha多樣性分析

Chao1指數曲線是反映樣品微生物豐富度的指標，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理。當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理，可以反映樣品中絕大多數細菌的物種信息[18-19]。基于高通量測序技術對臭豆腐生坯細菌的Chao1指數進行分析，5種臭豆腐生坯樣品Chao1指數曲線見圖1。

圖1 5種臭豆腐生坯樣品Alpha多樣性分析結果Fig.1 Alpha diversity analysis results of 5 kinds of stinky tofu Shengpei samples

從圖1可以看出，隨著序列數增加，樣品的Chao1指數均值＞150，說明5種樣品的物種多樣性和豐富度都較高。從樣品重復性稀釋曲線來看，在測序達到5 000以上基本趨于平緩，可以說明樣品基本可以代表樣品OTU實際情況，能夠反映樣品中微生物多樣性豐富程度，可以評價覆蓋所有微生物類群。

2.4 5種臭豆腐生坯樣品的主成分分析

采用PCA對五個樣品的多樣性進行分析，評估其種群結構的差異性和相似性。結果如圖2。由圖2可知，PC1和PC2貢獻率之和為87.21%。表明可以較好地反應各樣品在圖上的種群結構差異[20]。樣品HSJD2、PJX4和YYD1距離較近，但是JXF5和CGL3距離較遠。說明HSJD2、PJX4和YYD1菌群結構相似，而JXF5和CGL3與其他樣品的菌群結構差異較大。

圖2 5種臭豆腐生坯樣品主成分分析結果Fig.2 Principle component analysis results of 5 kinds of stinky tofu Shengpei samples

2.5 5種臭豆腐生坯樣品中物種注釋及分類

由圖3可知，5種樣品在門分類水平上共注釋到30個門類。其中擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）總和在5種不同樣品中均占80%以上占絕對優勢，說明這5種不同的樣品在門分類水平上有極大的相似性。擬桿菌門（Bacteroidetes）是腸道有益微生物，對膳食多糖有一定的降解作用[21]。其中ε-變形菌門（Epsilonbacteraeota）在樣品CGL3相對豐度達4%，而在其他4個樣品中相對豐度較少。而變形菌門（Proteobacteria）在樣品YYD1、HSJD2和PJX4較多，分別為5%、3%和1%。在其他2種樣品中相對豐度較少。綜上，YYD1、HSJD2和PJX4樣品相似且與樣品CGL3和JXF5差異明顯，與PCA結果相同。

圖3 5種臭豆腐生坯樣品微生物群落門水平分類比較Fig.3 Comparison of microbial community at phylum level classification of 5 kinds of stinky tofu Shengpei samples

由圖4可知，在屬分類水平上共注釋到31個屬類，普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae）在5種豆腐生坯樣品中相對豐富均占絕對優勢，特別是在JXF5中其相對豐度占70%以上。普雷沃氏菌屬有降解碳水化合物和蛋白質的作用[22]。越來越多的研究表明，普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae）是有益的腸道微生物群，可以降解消化膳食多糖[23-24]。其次是梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_13）和乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度較高。梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_13）在樣品CGL3的相對豐度超過15%，而乳桿菌屬（Lactobacillus）在樣品YYD1中相對豐度在20%以上。不同豆腐生坯微生物多樣性的差異可能是鹵水發酵過程中發酵不同的溫度、pH值以及周圍環境菌群所造成的影響。

圖4 5種臭豆腐生坯樣品微生物群落屬水平分類比較Fig.4 Comparison of microbial community at genus level classification of 5 kinds of stinky tofu Shengpei samples

3 結論

本研究通過高通量測序測定5種不同廠家臭豆腐生坯，共注釋到30個門類和31個屬類。根據PCA發現，樣品CGL3和JXF5差異較大。樣品YYD1、HSJD2和PJX4較為相似。根據物種的門和屬分類發現，擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae）在5種樣品都占絕對優勢，說明5種樣品具有一定的相似性。普雷沃氏菌屬和擬桿菌門在JXF5樣品中相對豐度均＞70%，兩者都為腸道有益微生物，對膳食多糖具有降解功能，有望通過促進腸道健康，成為改善健康和預防疾病的功能性食品。綜上所述，5種臭豆腐生坯中有益腸道的擬桿菌門和普雷沃氏菌屬含量較高，而梭菌屬和乳桿菌屬含量又差異較大。普雷沃氏菌屬大部分屬于嚴格厭氧菌，大多數為革蘭氏陰性細菌，而梭菌屬和乳桿菌屬屬于革蘭氏陽性細菌，為產氣的嫌疑微生物，這有待于下一步采用純培養方法將其中占據優勢微生物進行分離純化，鑒定其產氣能力和水平，為進一步采用有效控制措施奠定科學依據。