乳酸菌高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

李玉娥，馬 玲*

（山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801）

高密度培養(yǎng)技術可以大大提高培養(yǎng)液中的菌體密度，經高密度培養(yǎng)后菌體細胞密度會達到常規(guī)培養(yǎng)10倍以上，因而高密度培養(yǎng)后菌體的發(fā)酵特性會得到提高[1]。而乳酸菌作為常見的發(fā)酵劑，對其高密度培養(yǎng)具有重要意義。國內外對乳酸菌進行高密度培養(yǎng)的研究主要針對菌種的篩選、培養(yǎng)基成分的篩選及優(yōu)化、培養(yǎng)過程中工藝參數(shù)的控制以及培養(yǎng)模式的選擇[2]。菌種是決定高密度培養(yǎng)的關鍵因素，而培養(yǎng)基是促進菌體增殖的重要因素，國內外主要是通過培養(yǎng)基的改良或額外添加營養(yǎng)物質以促進菌體的進一步增殖[3-6]。培養(yǎng)過程工藝參數(shù)的控制主要包括對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、培養(yǎng)基pH的調控。培養(yǎng)模式主要有透析培養(yǎng)、膜過濾培養(yǎng)等[7]。王奎明等[8]研究得出在MRS培養(yǎng)基中加堿中和使pH達到6.4后再添加7.5%番茄汁、12%麥芽汁、5%海帶汁、2%乳清，在37 ℃培養(yǎng)12 h后保加利亞乳桿菌菌體濃度可達到1.0×1012CFU/mL。高松柏[9]研究發(fā)現(xiàn)在5%脫脂乳水解液和12%脫脂乳中培養(yǎng)乳酸菌時，通過加入緩沖鹽可以分別將活菌數(shù)提高3倍和6倍。CARVALHO A S等[10]研究發(fā)現(xiàn)在MRS培養(yǎng)基中加入NaCl或甘露糖對保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）Lb培養(yǎng)后菌體存活率更高。榮博涵等[11]研究發(fā)現(xiàn)通過連續(xù)流加補料高密度培養(yǎng)釀酒酵母30 h后達到最大生物量29.29 g/L。周杏榮等[12]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌LZ183E高密度培養(yǎng)最佳培養(yǎng)條件為葡萄糖25 g/L、酵母膏20 g/L、南瓜汁24 g/L、初始pH 6.5以及接種量2%，此優(yōu)化條件下，活菌數(shù)對數(shù)值達到了（9.20±0.04）lg（CFU/mL）。有關乳酸菌高密度培養(yǎng)優(yōu)化研究的報道很多[13-16]，但大部分的研究都集中于培養(yǎng)基碳源、氮源以及發(fā)酵過程的優(yōu)化，而高密度培養(yǎng)過程中發(fā)酵后期隨著營養(yǎng)物質的減少以及pH的下降，不利于菌體進一步增殖，有關緩沖鹽添加時間、添加緩沖鹽后的培養(yǎng)pH以及營養(yǎng)液的添加量等都對培養(yǎng)基質的環(huán)境條件改善以及菌體進一步的生長所需的營養(yǎng)物質都有重要的影響，因而本研究主要針對這些影響因素進行試驗。

本研究以嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亞乳桿菌混合菌種為發(fā)酵菌種[17]，牛乳為培養(yǎng)基，以菌落總數(shù)為評價指標，研究緩沖鹽（改變培養(yǎng)pH）添加時間、調節(jié)pH、營養(yǎng)物質的添加體積和后發(fā)酵時間對菌體密度的影響。通過單因素試驗篩選出適宜的因素水平范圍，利用響應面法研究混合菌種高密度培養(yǎng)的最佳工藝條件參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

混合菌種（嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=1∶1）：山西農業(yè)大學食品學院畜產實驗室保藏；鮮牛乳：山西農業(yè)大學動物科技學院；胡蘿卜、番茄：市售；乳清：山西農業(yè)大學畜產實驗室制作奶酪副產物。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgSO40.58 g，MnSO40.25 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

營養(yǎng)因子組成[18]：將番茄、胡蘿卜清洗干凈后榨汁，三層紗布濾后煮沸，冷藏待用，按照乳清∶番茄汁∶胡蘿卜汁∶牛奶=4∶6∶6∶5（V/V）配制。

1.2 儀器與設備

HPP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；BL-50立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海東亞壓力容器制造有限公司；SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；FE30K pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JYZ-V911榨汁機：九陽股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗優(yōu)化高密度培養(yǎng)條件

緩沖鹽添加時間對活菌數(shù)的影響：分別在培養(yǎng)第1.5、2.0、2.5、3.0、3.5小時加入經膜過濾的15%碳酸鈉緩沖溶液，調節(jié)pH為6.7，加入與原培養(yǎng)基等體積的營養(yǎng)因子（乳清∶番茄汁∶胡蘿卜汁∶牛奶=4∶6∶6∶5（V/V）），攪拌均勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后進行活菌計數(shù)。

培養(yǎng)pH值對活菌數(shù)的影響：分別在培養(yǎng)第2.5小時加入經膜過濾的15%碳酸鈉溶液，調節(jié)pH值為5.8、6.1、6.4、6.7、7.0，加入與原培養(yǎng)基等體積的營養(yǎng)因子，攪拌均勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后進行活菌計數(shù)。

營養(yǎng)因子添加量對活菌數(shù)的影響：在培養(yǎng)第2.5小時加入經膜過濾的15%碳酸鈉溶液，調節(jié)pH為6.7，加入原培養(yǎng)基25%、33%、50%、100%、200%的營養(yǎng)因子，攪拌均勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h后進行活菌計數(shù)。

后發(fā)酵時間對活菌數(shù)的影響：在培養(yǎng)第2.5 h時加入經膜過濾的15%碳酸鈉溶液，調節(jié)pH為6.7，加入與原培養(yǎng)基等體積的營養(yǎng)因子，攪拌均勻后繼續(xù)培養(yǎng)2.0 h、3.0 h、4.0 h、5.0 h、6.0 h后進行活菌計數(shù)。

1.3.2 響應面試驗優(yōu)化高密度培養(yǎng)條件

在單因素試驗的基礎上，以添加緩沖鹽時間（A）、培養(yǎng)pH值（B）、添加營養(yǎng)物質體積（C）、后發(fā)酵時間（D）為4個因素，以活菌數(shù)（Y）為響應指標，對4個因素進行3水平的Box-Behnken設計，響應面試驗因素與水平如表1。

表1 乳酸菌高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for lactic acid bacteria high-density culture conditions optimization

1.3.3 測定方法

菌落數(shù)：參照國標GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數(shù)的測定》進行測定。

2 結果與分析

2.1 緩沖鹽添加時間對活菌數(shù)的影響

由圖1可知，活菌數(shù)隨著添加緩沖鹽時間的不同先升高后降低，在發(fā)酵2.5 h后添加緩沖鹽溶液，活菌數(shù)最高為8.86 lg（CFU/mL）。這可能是由于培養(yǎng)第2.5小時乳酸大量積累，pH偏低，不利于乳酸菌的進一步增殖，而此時添加緩沖溶液可以有效調節(jié)pH[19]，解除過量乳酸對乳酸菌的抑制作用[20-21]，再加入營養(yǎng)物質后可以較好的進一步促進乳酸菌的生長。因此，選擇在發(fā)酵2.5 h時添加緩沖鹽溶液。

圖1 緩沖鹽添加時間對活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of buffer salt addition time on viable count

2.2 培養(yǎng)pH值對活菌數(shù)的影響

由圖2可知，活菌數(shù)隨著pH的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，pH調節(jié)為6.7時菌落總數(shù)最高，達到8.87 lg（CFU/mL）。有研究表明，牛奶pH在6.6左右最適合乳酸菌的生長繁殖[22]，而牛奶是乳酸菌生長繁殖的較好底物，乳酸菌已適應在接近牛奶pH的環(huán)境中生存。另外，加入緩沖鹽調節(jié)pH后中和了前體乳酸菌代謝生成的乳酸，降低了較低的pH條件對乳酸菌的不利影響，保證了后續(xù)生長相對穩(wěn)定的pH環(huán)境[15，21，23]。這與報道的乳酸菌R8高密度培養(yǎng)將pH調節(jié)為5.8的結果不同[14]，可能與選用的菌株不同、營養(yǎng)物質添加的不同以及培養(yǎng)模式的差異有關。因此選擇在發(fā)酵2.5 h時添加緩沖鹽溶液后將pH調節(jié)為6.7。

圖2 培養(yǎng)pH值對活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of culture pH value on viable count

2.3 營養(yǎng)因子添加量對活菌數(shù)的影響

由圖3可知，隨著營養(yǎng)因子添加量的增加，高密度培養(yǎng)后活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當加入原培養(yǎng)基等體積的營養(yǎng)物質時，活菌數(shù)最高為8.86 lg（CFU/mL）。而營養(yǎng)因子添加量的增大或減少，都不利于乳酸菌的高密度增殖。這可能是因為當加入較多的營養(yǎng)因子時盡管菌體密度會提高，但相對培養(yǎng)液的總體積也增大，最終單位菌落數(shù)會減小。而添加營養(yǎng)物質較少時，不能滿足菌體高密度繁殖所需的營養(yǎng)，最終單位菌落總數(shù)也會下降[24]。因此，選擇添加原培養(yǎng)液等體積的營養(yǎng)物質進行營養(yǎng)物質的補充。

圖3 營養(yǎng)因子添加量對活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of nutrition factor addition on viable count

2.4 后發(fā)酵時間對活菌數(shù)的影響

由圖4可知，當調節(jié)pH并加入營養(yǎng)物質后進一步培養(yǎng)，隨著后發(fā)酵時間的延長，菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢，當發(fā)酵時間達到4 h時菌數(shù)最高為9.13 lg（CFU/mL），而4 h后菌數(shù)又降低。這可能是因為進一步延長發(fā)酵時間會使乳酸菌代謝產生的乳酸增多，一定程度抑制了乳酸菌的繼續(xù)生長[25-26]，也可能與發(fā)酵4 h后營養(yǎng)物質被徹底利用有關。因此最終確定后發(fā)酵時間為4 h。

圖4 后發(fā)酵時間對活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of post-fermentation time on viable count

2.5 Box-Behnken試驗

利用Design-Expert軟件對表2數(shù)據進行回歸分析。得到以下回歸方程：

表2 乳酸菌高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for lactic acid bacteria high-density culture conditions optimization

Y=10.70-0.083A-0.18B-0.18C+0.10D-0.33AB-0.075AC+0.050AD+0.18BC+0.55BD+0.10CD-1.35A2-0.28B2-0.68C2-0.63D2

不同因素對菌落總數(shù)響應值影響的方差分析如表3所示。由表3可以看出，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），而失擬項不顯著（P＞0.05），因此得到的回歸方程有效，可利用該回歸方程進行相關的預測和控制。同時方程的決定系數(shù)R2=0.98，調整后的決定系數(shù)R2Adj=0.96，說明利用該回歸方程可以解釋變異中96%的變量之間的關系，響應值和各因素之間存在二次關系，方程可信度較高。方差分析中B、C因素對結果影響極顯著（P＜0.01），D因素影響顯著（P＜0.05），A因素影響不顯著（P＞0.05），說明在高密度培養(yǎng)過程中調節(jié)pH值和添加營養(yǎng)物質的體積對菌數(shù)的影響極顯著，而后發(fā)酵時間對菌數(shù)影響顯著，緩沖鹽添加時間對結果影響不顯著（P＞0.05），充分說明及時排除代謝生成的酸并補充營養(yǎng)物質對乳酸菌的高密度培養(yǎng)至關重要，而合適的后發(fā)酵時間也有重要影響，這些因素都是乳酸菌菌體不斷增加的關鍵因素。而交互作用中以A和B兩因素的交互作用、B和D兩因素之間的交互作用影響達到極顯著（P＜0.01），B和C因素之間的交互作用達到顯著（P＜0.05），其余兩因素之間的交互作用不顯著（P＞0.05），說明在高密度培養(yǎng)過程中兩因素必須同時考慮，也就是調節(jié)合適的pH后要添加適合的營養(yǎng)物質同時保證在后續(xù)發(fā)酵過程較好的增殖。各因素的平方項對結果影響極顯著（P＜0.01），這表明各因素與響應值之間不是簡單的線性關系。對交互作用顯著的A和B、B和C、B和D因素之間進行響應面和等高線分析，結果見圖5。由圖5可以看出，A和B、B和C、B和D因素之間的交互作用明顯，與方差分析的結果一致，通過響應面可知各因素對該響應值存在最大值。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

圖5 各因素交互作用對乳酸菌菌落總數(shù)影響的響應曲面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the total number of colonies of lactic acid bacteria

通過方程計算結果的最大值，由軟件分析和規(guī)劃求解計算得到編碼值，進行換算后得到理論最佳條件：緩沖鹽添加時間為2.05 h，培養(yǎng)pH值為6.46，添加原培養(yǎng)基107%的營養(yǎng)因子，后發(fā)酵時間3.88 h，此條件下培養(yǎng)液的活菌數(shù)模型預測值為5.73×1011CFU/mL。為驗證此模型下獲得工藝參數(shù)的可靠性，結合實際情況對以上工藝參數(shù)進行調整，確定最終合適的工藝參數(shù)為：緩沖鹽添加時間為2 h，培養(yǎng)pH值為6.5，添加原培養(yǎng)基等體積的營養(yǎng)因子，后發(fā)酵時間4 h，在此條件下進行驗證試驗，培養(yǎng)液的活菌數(shù)實際值為5.68×1011CFU/mL。實際數(shù)值與模型預測值接近，因而由此模型得到的結果可靠。

3 結論

經單因素試驗得出，乳酸菌高密度培養(yǎng)最佳條件為在發(fā)酵2.5 h 時添加緩沖液調節(jié)pH 至6.6，添加原發(fā)酵液等體積的營養(yǎng)因子后發(fā)酵4 h。結合響應面法得出乳酸菌高密度培養(yǎng)的最優(yōu)條件為在培養(yǎng)至2 h 時添加15%碳酸鈉緩沖液調節(jié)pH 值至6.5，同時添加與原培養(yǎng)基等體積的營養(yǎng)因子（乳清∶番茄汁∶胡蘿卜汁∶牛奶=4∶6∶6∶5）再培養(yǎng)4 h，在此條件下培養(yǎng)液的活菌數(shù)較高，為5.68×1011CFU/mL。