鹽濃度對自制香腸理化因子及原核微生物群落多樣性的影響

孫 筱

（石家莊職業技術學院 食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081）

香腸是我國傳統的腌臘肉制品，通常由攪碎的生豬肉、鹽、糖、白酒、料酒等原料在自然環境下發酵25～30 d制成[1]。香腸因具有醇香可口、外形美觀、色澤鮮艷、皮薄肉嫩等特點，深受廣大中國消費者喜愛[2]。香腸在發酵過程中經歷了多種微生物的更迭及復雜的物理化學變化，而香腸的發酵會受到鹽度和溫度等工藝條件的影響。鹽作為重要的配料，一直被用來改善咸味和延長肉制品保質期。鹽可以抑制發酵過程中有害微生物的生長代謝。此外，鹽也能降低乳酸菌的生物量和代謝速率[3]。因此，鹽可以直接或間接地影響香腸發酵過程中微生物群落結構，從而影響香腸的品質特征。ROSEIRO L C等[4]研究對比發現，6%鹽濃度的葡式干發酵香腸相比3%鹽濃度的香腸在成熟后具有更低的pH值和水分含量。黃鄭朝等[5]研究發現，不同工藝和地域的傳統發酵香腸的微生物組成存在差異。此外，田星等[6]研究發現，食鹽添加量為3%時，香腸出品率和保水性最好。

16S rRNA高通量測序技術和生物信息學分析可以全面解析傳統釀造食品的微生物群落組成，從而了解各種釀造微生物的發酵功能。許多研究表明，香腸發酵初期主要以弧菌屬（Vibrio）、不動桿菌屬（Acinetobater）、腸桿菌屬（Enterobacter）、耶爾森菌屬（Yersinia）和環絲菌屬（Brochothrix）為主，而后期則以乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）為主[2，7]。香腸發酵作為一種典型的厭氧發酵微生態系統，有利于乳酸菌等厭氧微生物的增殖。研究表明，明串珠菌屬（Leuconostoc）是低鹽香腸發酵中期的優勢微生物，隨著發酵的不斷進行，乳桿菌屬（Lactobacillus）為低鹽香腸后期的優勢菌群[8-9]。此外，DI GIOIA D等[10]研究發現，意大利發酵香腸中的乳酸菌可以代謝碳水化合物生成有機酸，并且產生細菌素抑制其他病原菌的生長繁殖。

本研究基于16S rRNA高通量測序技術探究鹽濃度對自制香腸原核微生物多樣性及理化因子的影響，揭示不同鹽濃度處理下香腸原核微生物群落的結構組成差異，通過冗余分析（redundancy analysis，RDA）確定理化因子與原核微生物群落的關系。為探明自制香腸原核微生物多樣性、不同鹽濃度對香腸原核微生物多樣性的影響及香腸發酵微生態調控提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮生豬肉、腸衣、食鹽、糖：市售。

硝酸銀、氯化鈉、鉻酸鉀、碘化鉀、乙酸、硫代硫酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；PowerSoil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國Mobio公司；Q5高保真DNA聚合酶：英國NEB公司；細菌16S rDNA V3-V4區擴增引物（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）：廣州基迪奧生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PB-10型pH計：德國Sartorius公司；TGL-20M型高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；Illumina Miseq PE250型測序儀：美國Illumina公司；NanoDrop 2000型超微量分光光度計：美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香腸的制作

參考WANG X H等[7]的工藝制作香腸，具體方法如下：將新鮮生豬肉分為瘦肉和肥肉，切成2.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的塊狀，分別加入3%蔗糖、2%白酒、1%料酒和1%醬油，最后加入不同質量分數的食鹽（不添加食鹽：Z組；添加食鹽質量分數2%：T組；添加食鹽質量分數4%：F組；添加食鹽質量分數6%：S組），充分混勻，將混合物裝入直徑為10 cm的天然腸衣中。將香腸置于10～15 ℃的環境進行自然發酵30 d。在發酵完成后收集各組香腸樣本，并儲存于-20 ℃冰箱中，用于DNA提取及理化因子測定。

1.3.2 理化指標分析

使用pH計測定香腸樣品的pH值；參照國標GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》測定水分的含量[11]；參照國標GB 5009.44—2016《食品中氯化物的測定》測定氯化鈉的含量[12]；參照國標GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛生標準分析方法》測定過氧化值[13]。

1.3.3 DNA提取與Miseq高通量測序

1.3.4 序列分析

將測序數據根據條形碼進行劃分，并使用FLASH軟件[14]進行拼接，隨后使用Trimmomatic軟件[15]過濾低質量的序列，利用UCHIME軟件[16]去除嵌合體，得到優質序列。根據USEARCH軟件[17]在相似性97%的水平上進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，得到代表序列。使用Silva 138數據庫[18]對代表序列進行比對注釋，生成不同分類水平上的物種豐度表，并刪除不能注釋到門水平的OTU。基于OTU表計算各樣品的α-多樣性指數及各注釋水平的相對豐度。使用R軟件實現未加權（unweighted）UniFrac距離算法的主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）與冗余分析。

1.3.5 統計分析

所有柱狀圖均用Graphpad Prism軟件繪制。采用SPSS 20.0軟件進行方差分析，P＜0.05 時認為具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 鹽濃度對香腸理化性質的影響

不同鹽濃度對香腸pH、水分含量、鹽度和過氧化值的影響見圖1。

圖1 鹽濃度對香腸pH值（A）、水分含量（B）、鹽度（C）和過氧化值（D）的影響Fig.1 Effect of salt concentration on pH value (A),moisture contents (B),salinity (C) and peroxide value (D) of sausage

由圖1可知，相比Z組，添加食鹽均會顯著降低香腸pH（P＜0.05），而F組pH最低，為5.84，與S組無顯著差異（P＞0.05）。鹽會抑制有害微生物分解蛋白質產生胺、氨等堿性物質[19]。此外，鹽會促進乳酸菌的大量繁殖分解碳水化合物產生乳酸，導致產品pH下降[19]。水分含量隨著鹽濃度的升高而降低。相比Z組，添加食鹽均會顯著降低香腸的水分含量（P＜0.05），但F和S組無顯著差異（P＞0.05）。Z、T、F和S組的鹽度分別約為0、1.71%、3.46%和5.58%。過氧化物是脂類氧化的第一個中間產物，其性質極不穩定，可分解為醛、酮及酸等小分子物質[20]，因此過氧化值可反映香腸受到氧化的程度。Z組的過氧化值最高，可達25.12 mmol/kg，顯著高于T、F和S組（P＜0.05），而T、F和S組的過氧化值在18.59～19.76 mmol/kg之間，表明鹽可以降低香腸的過氧化值。過氧化值過高會使香腸產生哈敗味，但適量范圍內的過氧化值有益于香腸獨特風味的形成[21]。

2.2 鹽濃度對測序數據與α-多樣性的影響

不同鹽濃度對香腸測序數據和α-多樣性的影響見表1。由表1可知，不同鹽濃度香腸樣品（12個）的Illumina Miseq測序原始序列經過樣本拆分、拼接和過濾后共獲得653 001條優質序列，且各組樣品的優質序列數目無顯著差異（P＜0.05）。香腸樣品的測序覆蓋率均在97%以上，且各組樣品之間無顯著差異（P＜0.05），表明測序結果足以表征香腸中原核微生物群落的多樣性。與Z組相比，T組、F組和S組具有較少的OTU和Chao1指數（P＜0.05），說明鹽會抑制不耐鹽微生物的生長繁殖，從而改變香腸內的原核微生物群落結構。該結果與GAN X等[22]研究結果相一致。此外，除T組的Simpson指數之外，T組、F組和S組的Shannon指數和Simpson指數均顯著低于Z組（P＜0.05），進一步說明鹽的加入會降低香腸內的原核微生物的物種多樣性。OTU、Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數均存在鹽濃度抑制性，隨著鹽度的不斷增加，這些α-多樣性參數均呈下降趨勢，但F組和S組的α-多樣性參數均無顯著差異（P＜0.05）。上述結果與圖1的結果相一致，推測這種現象與香腸發酵環境有關，食鹽添加量會影響微生物群落結構，從而改變群落α-多樣性[22]。

表1 鹽濃度對香腸原核微生物群落序列數量和α-多樣性參數的影響Table 1 Effect of salt concentration on sequence numbers and α-diversity parameter of prokaryotic microbial communities of sausage

2.3 鹽濃度對β-多樣性的影響

基于未加權UniFrac距離算法將OTUs縮放至距離矩陣中，隨后使用PCoA比較不同鹽濃度香腸內原核微生物群落的差異。不同鹽濃度對香腸β-多樣性的影響見圖2。由圖2可知，PCoA第一軸和第二軸顯示物種累積百分比方差值分別為90.54%和2.69%。總的來說，93.23%的物種差異可以用兩個軸來解釋。不同鹽濃度香腸樣品中原核微生物群落結構的組間差異顯著（不同鹽濃度香腸樣品在其投影平面上的距離較遠），尤其是Z組和其他組之間的差異較大。上述結果表明不同鹽濃度香腸內原核微生物類群呈現出明顯的組成差異，與CHEN J X等[23]研究結果相一致。

圖2 鹽濃度對香腸原核微生物群落β-多樣性的影響Fig.2 Effect of salt concentration on β-diversity of prokaryotic microbial communities of sausage

2.4 鹽濃度對原核微生物群落組成與結構的影響

不同鹽濃度對香腸內原核微生物群落門水平的影響見圖3。由圖3可知，經OTUs注釋，所有樣品中共檢測到12個可鑒定門，其中最主要的門是厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、彎曲桿菌門（Campilobacterota）和擬桿菌門（Bacteroidota）。厚壁菌門和變形菌門在香腸中占絕對優勢地位，二者之和占總相對豐度的98%以上。隨著鹽度的不斷增加，厚壁菌門的平均相對豐度從63.52%升高至88.81%；而變形菌門的平均相對豐度則持續降低，從34.36%降低至10.01%。上述結果表明，鹽主要是通過改變厚壁菌門與變形菌門的比例來調節香腸內原核微生物群落結構。

圖3 鹽濃度對香腸原核微生物群落門水平的影響Fig.3 Effect of salt concentration on phylum level of prokaryotic microbial communities of sausage

不同鹽濃度對香腸內原核微生物群落屬水平的影響見圖4。由圖4可知，基于層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）可將所有樣品劃分為2個簇，Z組樣品單獨聚為1簇（Ⅰ），其他組樣品聚為另一簇（Ⅱ）；第Ⅱ簇又可以分為3個亞簇，T組樣品聚在第ⅰ亞簇，S組樣品聚在第ⅱ亞簇，F組樣品聚在第ⅲ亞簇，該結果與圖2的結果相一致，說明鹽會顯著改變香腸樣品中原核微生物的組成。在屬水平上，香腸中較多的是乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、弧菌屬（Vibrio）、乳球菌屬（Lactococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）?；【鷮俸筒粍訔U菌屬是腐敗致病菌，其在Z組中相對豐度分別為18.66%和7.49%，而其他添加食鹽組的樣本中弧菌屬和不動桿菌屬的相對豐度范圍分別為1.19%～7.34%和0.23%～4.22%，與Z組差異顯著（P＜0.05）?；【鷮偈鞘称分械闹虏【?，會引發腹瀉、嘔吐、頭痛等[24]。不動桿菌屬是肉制品中常見的腐敗菌之一，具有不耐酸和不能利用葡萄糖等特征[25]。

圖4 鹽濃度對香腸原核微生物群落屬水平的影響Fig.4 Effect of salt concentration on genus level of prokaryotic microbial communities of sausage

歐文氏菌屬（Erwinia）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、Malaciobacter、假單胞菌屬（Pseudomonas）和耶爾森氏菌屬（Yersinia）主要在Z組中富集，隨著鹽度的不斷升高，這些微生物的平均相對豐度持續降低。乳桿菌屬是香腸中占比最大的微生物，其相對豐度在30.29%～58.15%。相比Z組，添加食鹽可顯著增加乳桿菌屬相對豐度（P＜0.05），其F組中乳桿菌屬的相對豐度最高。乳酸菌可能來源于肉類和自然環境，可將肉類中的小分子糖類物質轉化為酸類化合物，賦予香腸柔和的酸感[26]。此外，乳酸菌可通過蛋白水解系統將發酵基質中可溶性蛋白分解短肽和氨基酸等小分子代謝產物，從而賦予產品獨特的鮮味特征[27]。

魏斯氏菌屬相對豐度隨鹽度的不斷增加呈逐漸升高的趨勢，在Z組中相對豐度最低，僅為3.89%；而在T組、F組和S組中分別可達12.73%、13.76%和23.90%，成為優勢菌屬。魏斯氏菌屬具有耐鹽等特性，且可以代謝碳水化合物，為其自身生長繁殖提供能量[2]。此外，魏斯氏菌屬和乳桿菌屬是互利共生關系，魏斯氏菌屬可以合成葡萄聚糖、異麥芽低聚糖等低聚糖來促進乳桿菌屬中益生菌的增長[28]，導致乳桿菌屬成為香腸中豐度最高的優勢屬，而乳桿菌屬產生的酸性代謝物質會抑制不耐酸微生物的生長繁殖，減弱與魏斯氏菌屬對碳源的競爭。鹽單胞菌屬（Halomonas）、片球菌屬（Pediococcus）、鹽弧菌屬（Salinivibrio）和四聯球菌屬（Tetragenococcus）的變化趨勢與魏斯氏菌屬（Weissella）的變化相一致，其在Z組的相對豐度分別為0.38%、0.13%、0和0，而在S組的相對豐度分別為3.23%、5.25%、1.21%和3.33%。鹽單胞菌屬和片球菌屬具有耐鹽的特性，能分解葡萄糖，產生多種風味物質[29]。四聯球菌屬廣泛存在與含鹽的腌制類發酵食品中，可參與氨基酸的合成及生成醛、醇、酮和酯等揮發性風味物質，從而提升發酵食品的風味和口感[29]。

2.5 理化因子與原核微生物群落的相關性

理化因子是影響釀造食品微生物群落組成的主要因素。在本研究中，冗余分析被用來辨別香腸原核微生物群落和理化因子之間的相關性。理化因子與原核微生物群落的相關性見圖5。由圖5可知，理化因子對原核微生物群落結構前兩個標準軸的解釋貢獻率分別為60.46%和10.64%，可將不同鹽度香腸樣品較好的區分開。多個理化因子共同影響香腸中原核微生物群落結構，其中Z組原核微生物群落與水分含量、pH值、過氧化值呈正相關；T組原核微生物群落只與水分含量呈正相關；而F組和S組則與鹽度呈正相關。此外，乳桿菌屬（Lactobacillus）與水分含量呈正相關；弧菌屬（Vibrio）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、歐文氏菌屬（Erwinia）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和乳球菌屬（Lacto coccus）與水分含量、pH值、過氧化值呈正相關；鹽單胞菌屬（Halomonas）、片球菌屬（Pediococcus）、鹽弧菌屬（Salinivibrio）、四聯球菌屬（Tetragenococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）與鹽度呈正相關。利用條件限制分析探究每個理化因子對原核微生物群落結構的影響程度，其中鹽度（30.29%）對菌群的影響最大，其次為pH（26.08%），進一步說明多個理化因子共同決定不同鹽度香腸原核微生物群落的變化。

圖5 香腸樣品的原核微生物群落和理化因子冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of prokaryotic microbial communities and physicochemical factors of sausage samples

3 結論

本研究采用16S rRNA高通量測序技術揭示鹽濃度對自制香腸原核微生物群落多樣性的影響，同時分析鹽濃度對自制香腸理化因子的影響。鹽可以顯著影響pH、水分含量及過氧化值，并且也會顯著影響原核微生物的多樣性和組成。隨著鹽濃度的不斷增加，OTU、Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數均呈下降趨勢。在門水平上，厚壁菌門和變形菌門占絕對優勢地位，厚壁菌門的平均相對豐度隨香腸中鹽濃度升高而增加，而變形菌門則呈相反的變化趨勢。在屬水平上，乳桿菌屬是香腸原核微生物的絕對優勢菌屬，其相對豐度在30.29%～58.15%范圍之間。明串珠菌屬、弧菌屬、不動桿菌屬、魏斯氏菌屬、鹽單胞菌屬、片球菌屬、鹽弧菌屬和四聯球菌屬受鹽添加量的影響顯著。此外，冗余分析結果表明原核微生物群落結構與鹽度呈正相關，且鹽度對菌群的影響最大。綜上所述，添加4%食鹽的香腸具有更高的乳酸菌豐度。本研究有助于了解加鹽對香腸發酵微生態的影響，為香腸的質量控制提供科學依據。