產類胡蘿卜素酵母菌的篩選及色素穩定性分析

朱麗花，馬延琴，紀彥宇，李春燕，鐘晨曉，孫慶強，王 斌，史學偉*

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000）

類胡蘿卜素是一大類類異戊二烯色素，廣泛分布于各類植物和微生物[1]。這些親脂性代謝產物不溶于水，起著生色團的作用（400～500 nm是類胡蘿卜素最大吸收的電磁光譜），使生物體呈現橙色、黃色、微紅色等特征[2-3]。長期以來，類胡蘿卜素在食品、化妝品、制藥、營養保健品、飼料等行業應用廣泛，主要歸功于其生物學功能，如具有很高的抗氧化活性，可以保護細胞膜免受光、氧化和自由基的破壞。類胡蘿卜素作為維生素A的前體、活性氧的清除劑和體外抗體產生的促進劑，可以降低患癌癥的風險和預防心血管疾病[4-5]。除此之外，類胡蘿卜素對于保持某些特性和促進微生物的生長至關重要[6-7]。

與從植物和化學合成生產類胡蘿卜素相比，微生物生產類胡蘿卜素更具優勢，如低成本，批次之間的差異較小，易于操作，且沒有季節或地理變化，生產周期短。能夠生產類胡蘿卜素廣泛的微生物包括霉菌類、酵母類、細菌類和藻類[8-9]。近年來，相關研究表明酵母菌具有單細胞特性和高生長速率，有生產大量類胡蘿卜素的潛能。產類胡蘿卜素的酵母被認為無處不在，因為廣泛分布在陸地、淡水、海洋等環境中，能夠同化各種碳源如葡萄糖、蔗糖、甘油、木糖等[10]。目前，研究發現能產生類胡蘿卜素的酵母主要包括紅冬孢酵母屬（Rhodosporidiumspp.）、擲孢酵母屬（Sporobolomycesspp.）、紅法夫酵母屬（Phaffiaspp.）及紅酵母屬（Rhodotorulaspp.）等[11-13]。其中，利用紅酵母生產類胡蘿卜素營養要求簡單、生長周期短、菌體營養豐富，開發前景廣闊。

然而，目前用于工業化生產類胡蘿卜素的微生物資源還很有限，從自然界中分離高產類胡蘿卜素且安全無毒的優良菌株具有較高的研究價值和應用前景。另外，天然色素容易受到溫度、氧化劑、還原劑等因素的影響而限制了其應用。因此色素的穩定性是色素應用中的一個重要問題。本實驗采用傳統微生物分離方法從赤霞珠釀酒葡萄表皮分離鑒定高產類胡蘿卜素的酵母菌株，優化其發酵條件，并對其胞外色素穩定性進行了探究，為采用發酵法生產類胡蘿卜素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒葡萄赤霞珠：采于新疆五家渠市；酵母脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；酵母浸粉、瓊脂粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、過氧化氫、丙酮、檸檬酸、蘋果酸、氫氧化鈉、檸檬酸鈉（均為分析純）：天津市盛奧化學試劑有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、PDA液體培養基：常德比克曼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-250B生化培養箱：常州諾基儀器有限公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋：廣州柯僑實驗技術有限公司；ZWYR-211D大容量恒溫培養搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；LD5-2A低速離心機：北京醫用離心機廠；UV-2800紫外-可見分光光度計：尤尼柯（上海）有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；BPG-9240A電熱風干燥箱：上海一恒科技儀器有限公司；CP114分析電子天平：美國奧豪斯科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產類胡蘿卜素酵母菌株的分離和篩選

將無菌操作采集的葡萄樣品加入到50 mL無菌生理鹽水中，28 ℃、170 r/min處理30 min。對樣品預處理液10倍稀釋依次得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5菌懸液。分別吸取各梯度菌懸液200 μL于PDA培養基上，涂布均勻，每個樣品涂布3個平板。28 ℃倒置培養48 h，根據菌落形態、顏色及顯微鏡下菌體細胞的形態觀察結果，選取疑似紅酵母菌落進行純培養，直至平板上無不同菌落特征菌株。

1.3.2 高產類胡蘿卜素酵母菌的篩選

將各待試菌株從保存斜面移接到活化培養基上，28 ℃培養48 h。將菌種接種于裝有50 mL PDA液體培養基中28 ℃振蕩（200 r/min）培養24 h，得到預培養物。將預培養物轉移到50 mL PDA液體培養基中，接種量為2%，28 ℃振蕩（200 r/min）發酵48 h。根據菌體干質量測定菌株的生長情況，發酵結束后經離心收集菌體并測定生物量和類胡蘿卜素產量，確定類胡蘿卜素高產菌株。

1.3.3 高產類胡蘿卜素酵母菌株的鑒定

（1）形態及生理生化鑒定

參照文獻[14]方法對高產類胡蘿卜素酵母菌株的形態及生理生化特征進行初步鑒定。

（2）分子生物學鑒定

采用Fungi Genomic DNA Extraction Kit提取菌株基因組DNA，以其為模板進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。使用正向引物ITS1（5'-TCCGTAGTGAACCTGCGG-3'）和反向引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATGC-3'）對內轉錄間隔區（internal transcribed spacers，ITS）進行擴增[15]。PCR擴增體系為預混液25 μL，正反引物（10 μm）各2 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水19 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性10 min；92 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化后送至北京生工基因測序公司進行測序，將獲得的序列與GeneBank庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）中進行基本局部比對搜索工具（basic localalignmentsearchtool，BLAST）比對分析，鑒定種屬信息。根據序列采用MEGA6.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining）進行聚類分析，構建系統發育樹。

1.3.4 培養基的優化

碳源的優化：分別以葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、阿拉伯糖、乳糖、甘露糖為碳源，添加量為2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，考察不同碳源對類胡蘿卜素產量的影響。

氮源的優化：分別以蛋白胨、甘氨酸、賴氨酸、硝酸銨、硫酸銨作為氮源，添加量為2%，酵母浸粉1%，葡萄糖2%，考察不同氮源對類胡蘿卜素產量的影響。

將菌株接種在含有50 mL發酵培養基的錐形瓶中，接種量為3%（V/V），在120 r/min、28 ℃條件下培養5 d。發酵結束后，以干細胞生物質量（dry cell mass，DCM）（g/L），類胡蘿卜素產量（mg/L）和細胞類胡蘿卜素（μg/g干酵母）的形式測定細胞生長，選出最合適酵母菌生長的碳源和氮源。所有搖瓶實驗均平行3份進行。

1.3.5 類胡蘿卜素提取與測定

（1）生物量測定

生物量的測定按照參考文獻[16]進行。具體操作如下：吸取4 mL發酵液加入已烘干稱質量的5 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，棄去上清液。菌體沉淀物用蒸餾水洗滌，同樣條件下離心后棄去上清液。將含菌體的離心管在105 ℃條件下烘干至質量恒定，置于干燥器中冷卻至室溫后稱質量，按下式計算生物量：

式中：M為帶菌體管干質量，g；M0為空管干質量，g；V為發酵液體積，mL。

（2）類胡蘿卜素提取

類胡蘿卜素的提取按照文獻[17]進行。為裂解細胞，將0.05 g干細胞浸泡在3 mL鹽酸（3 μmol/L）中，25 ℃浸泡1 h，沸水中加熱4 min，冰浴冷卻5 min，8 000×g離心5 min，棄上清得菌體沉淀。菌體沉淀用蒸餾水洗滌后同樣條件下離心得沉淀，將沉淀懸浮在8 mL的丙酮溶液中，振蕩均勻，8 000×g離心10 min收集上清。上清液用紫外-可見分光光度計在475 nm波長處測定總胡蘿卜素的含量。類胡蘿卜素產量按下式計算：

式中：Aλmax為類胡蘿卜素最大吸收波長下的吸光度值；V為提取所用溶劑量，mL；D為測定試樣時的稀釋倍數；W為酵母菌體干細胞質量，g；0.16為類胡蘿卜素消光系數。

（3）類胡蘿卜素胞外穩定性測定

在熱穩定性測試中，將色素提取液分別置于20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃的水浴鍋中保溫，孵育1 h后冷卻，用紫外-可見（UV-Vis）分光光度計（475 nm）進行分析。配制含量為0.5%、1.5%、3.0%的過氧化氫丙酮溶液，分別加入類胡蘿卜素提取液中，定時測定其在475 nm處的吸光度值，以測試氧化劑對其穩定性的影響。在含有色素提取液的試管中加入抗壞血酸、亞硫酸鈉，使其含量為0.1%，放置于室內暗處，定時測定其在475 nm處的吸光度值，以測試還原劑對其穩定性。為了研究pH穩定性，在類胡蘿卜素提取液中分別添加檸檬酸、蘋果酸、氫氧化鈉和檸檬酸鈉，使其濃度為0.1%，放置于室內暗處，定時測定其在475 nm處的吸光度值。其中，吸光度值下降率按下式計算：

式中：A0為起始A475nm；A為處理后的A475nm。

1.3.6 數據處理與分析

每個實驗均重復3次，數據統計采用Excel 2010軟件，圖形繪制采用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 產類胡蘿卜素酵母菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌落及細胞形態觀察

從釀酒葡萄表皮分離得到6株粉紅色菌落，根據菌落形態/顏色不同，分別編號為Y1、Y5、Y7、Y9、Y10、Y14。將具有產類胡蘿卜素能力的酵母菌在平板上培養后，進行菌落形態及個體形態觀察。各菌株的菌落形態如圖1所示，細胞形態見圖2。

圖1 分離酵母菌的菌落形態Fig.1 Colony morphology of isolated yeasts

圖2 分離酵母菌的細胞形態Fig.2 Cell morphology of isolated yeasts

結果表明，6株酵母菌在平板培養4 d后，菌株Y1、Y5、Y10、Y14呈粉色，菌株Y7、Y9呈粉紅色，且所有酵母菌落均為邊緣整齊的圓形，表面光滑，質地黏稠，不透明，有光澤，凸起，且菌落直徑較大；在顯微鏡下觀察，細胞形態均為橢圓。

2.1.2 高產類胡蘿卜素酵母菌種的篩選

對6株酵母菌株進行培養，4 d后分別測定生物量和類胡蘿卜素含量及產量，結果見圖3。從圖3可知，類胡蘿卜色素產量最高的酵母是菌株Y7（12.93 mg/L），其次是菌株Y5（11.71 mg/L）。菌株Y10（7.09 mg/L）和菌株Y1（5.18 mg/L）產量較低。這些結果表明，菌株Y7具有較強的類胡蘿卜素產生能力，通過條件優化或遺傳改良，有可能成為一株新的類胡蘿卜素高產菌株。

圖3 6株酵母菌的生物量及類胡蘿卜素產量Fig.3 Biomass and carotenoid production of 6 strains of yeast

2.1.3 高產類胡蘿卜素酵母菌株生理生化測定

菌株Y7的生理生化特性結果見表1。由表1可知，碳源同化實驗結果顯示，該菌株能利用葡萄糖、木糖等8種糖，不能利用海藻糖，能利用甘油、檸檬酸、蘋果酸，不能利用甲醇、乙醇；氮源同化實驗結果顯示，該菌不能利用亞硝酸鈉，能利用硫酸銨、蛋白胨、硝酸銨、甘氨酸和賴氨酸。生理生化檢測結果顯示，該菌不產酸，無類淀粉產物產生。

表1 分離菌株Y7的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of isolated strain Y7

2.1.4 分子生物學鑒定

對分離得到的高產類胡蘿卜素酵母菌Y7進行了ITS基因序列測定。利用GenBank數據庫中的BLAST結合系統發育分析，發現菌株Y7與紅酵母屬（Rhodotorulaspp.）有很高的相似性，特別是與Rhodotorula glutinis的親緣性較近。用鄰接法構建了菌株Y7及其近緣種的系統發育樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株Y7與Rhodotorula glutinis形成了一個簇，表明菌株Y7屬于粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）。

圖4 基于ITS基因序列分離的菌株Y7的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the isolated strain Y7 based on ITS gene sequences

2.2 碳源和氮源種類對菌株Y7產類胡蘿卜素的影響

2.2.1 碳源種類的影響

碳源通過影響類胡蘿卜素合成基因的轉錄和提供代謝前體，在類胡蘿卜素的形成過程中起著重要作用。不同碳源對菌株Y7細胞生長和胡蘿卜素合成的影響見圖5。由圖5可知，在添加葡萄糖和果糖的培養基中，類胡蘿卜素的產量相對較高，其中葡萄糖被證明是最適合類胡蘿卜素生產的碳源，類胡蘿卜素產量為13.67 mg/L。菌株Y7在添加乳糖的培養基中生長較好，菌體干質量為24.63 g/L。在含有可溶性淀粉、阿拉伯糖、乳糖、D-甘露糖的培養基中，類胡蘿卜素合成受到不同程度的抑制。結果表明，葡萄糖和果糖是提高生物量和類胡蘿卜素產量的較好碳源，而可溶性淀粉、阿拉伯糖、乳糖、D-甘露糖則不利于提高類胡蘿卜素的產量。對于這一現象有幾種可能的解釋：①葡萄糖或果糖可能提高類胡蘿卜素合成基因的轉錄水平；②碳源對類胡蘿卜素合成的影響也與菌株有關[18-20]。結合實驗結果，選擇葡萄糖作為碳源。

圖5 不同碳源對菌株Y7生物量和類胡蘿卜素產量的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on biomass and carotenoid production of strain Y7

2.2.2 氮源種類的影響

在微生物發酵類胡蘿卜素過程中，需要對培養條件進行優化，以充分發揮所選微生物菌株的潛力。不同氮源對菌株Y7細胞生長和胡蘿卜素合成的影響如圖6所示。由圖6可知，在不同培養條件下，生物量在8.03～14.98 g/L之間，變化較大，總類胡蘿卜素含量在6.41～13.44 mg/L之間。在含有蛋白胨、甘氨酸和賴氨酸的培養基中，生物量沒有明顯差異。在蛋白胨培養基中，類胡蘿卜素含量最高，為13.44 mg/L，菌體干質量最高為14.98 g/L，是最低產量的1.87倍。在含有硝酸銨和硫酸銨的培養基中，菌體生長和類胡蘿卜素的合成受到抑制。因此，與有機氮源（蛋白胨、甘氨酸、賴氨酸）相比，無機氮源（硝酸銨和硫酸銨）對該菌的生長和類胡蘿卜素含量有較強的抑制作用。一個可能的原因是有機氮源不僅提供了氮，而且還起到了碳源的作用[21]。綜上選擇蛋白胨作為培養基氮源。

圖6 不同氮源對菌株Y7生物量和類胡蘿卜素產量的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on cell biomass and carotenoid production of strain Y7

2.3 菌株Y7產類胡蘿卜素胞外穩定性測試

2.3.1 溫度對菌株Y7產類胡蘿卜素胞外穩定性的影響

溫度被認為是直接影響細菌生長速率的主要物理因素，通過影響酶的表達和活性來影響類胡蘿卜素的合成，在類胡蘿卜素的生物合成中起著重要的作用[22]。色素提取液分別在溫度20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃條件下孵育5 h，以測試溫度的影響，結果見圖7。由圖7可知，20～60 ℃條件下加熱類胡蘿卜素，吸光度值下降率呈先穩定后逐漸升高的趨勢。在40～60 ℃下，吸光度值下降率變化較大，說明類胡蘿卜素高溫（＞40 ℃）條件下不穩定。

圖7 不同溫度對菌株Y7產類胡蘿卜素胞外穩定性的影響Fig.7 Effect of different temperature on extracellular stability of carotenoids produced by strain Y7

2.3.2 氧化劑和還原劑對菌株Y7產類胡蘿卜素胞外穩定性的影響

在類胡蘿卜素提取液中加入不同濃度的過氧化氫后，其吸光度值下降率曲線見圖8。由圖8可知，隨著過氧化氫濃度的增加，類胡蘿卜素溶液的吸光度值下降率也逐漸增加。但是在0.5%過氧化氫條件下，色素的吸光度值下降率上升幅度相對較小，說明其對類胡蘿卜素穩定性影響相對較小。由此可見，類胡蘿卜素對低濃度過氧化氫是相對穩定的，具有一定的抗氧化活性。

圖8 不同濃度H2O2對菌株Y7類胡蘿卜素胞外穩定性的影響Fig.8 Effect of different H2O2 concentration on extracellular stability of carotenoids produced by strain Y7

不同還原劑對菌株Y7類胡蘿卜素胞外穩定性的影響見圖9。由圖9可知，在還原劑處理過程中，隨著時間的延長，類胡蘿卜素溶液的吸光度值下降率逐漸上升，但上升幅度較小。在0.1%的亞硫酸鈉的作用下，5～30 h范圍內色素溶液吸光度值下降率從3.75%上升至10.63%，而在0.1%的抗壞血酸的作用下，色素溶液吸光度值下降率從1.88%上升至11.25%。還原劑對類胡蘿卜素穩定性有一定的影響，隨著放置時間增加，穩定性降低，但是類胡蘿卜素吸光度值變化相對較小。

圖9 不同還原劑對菌株Y7產類胡蘿卜素胞外穩定性的影響Fig.9 Effect of different reducing agents on extracellular stability of carotenoids produced by strain Y7

2.3.3 酸度調節劑對菌株Y7產類胡蘿卜素胞外穩定性的影響

在類胡蘿卜素提取液中加入不同酸度調節劑后，其吸光度下降率與色素溶液存放時間的關系曲線見圖10。由圖10可知，加入檸檬酸和檸檬酸鈉，類胡蘿卜素溶液的吸光度值降低，但下降的幅度較小。隨著時間的延長，吸光度值下降率有所增加，但是增加幅度較低。所以檸檬酸和檸檬酸鈉對類胡蘿卜素穩定性影響較小。加入蘋果酸和氫氧化鈉，隨著時間的延長，類胡蘿卜素溶液的吸光度值逐漸升高使其吸光度值下降率呈現負值，說明蘋果酸和氫氧化鈉對類胡蘿卜素有增色的效果。

圖10 不同酸度調節劑對菌株Y7產類胡蘿卜素胞外穩定性的影響Fig.10 Effect of different acidity regulator on extracellular stability of carotenoids produced by strain Y7

類胡蘿卜素在酸性pH下的敏感度較高，而在中性或堿性條件下的穩定性較高，可能是強酸性pH會導致酶的變性、細胞結構的扭曲和類胡蘿卜素合成的抑制，導致生長緩慢和類胡蘿卜素含量低[23]。另外，蘋果酸是另一個重要因素，因為它在代謝途徑中順序產生并與類胡蘿卜素形成有關。添加蘋果酸可支持更高類胡蘿卜素含量。這可能是因為蘋果酸是三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）循環的中間產物，對于類胡蘿卜素和脂質生物合成過程中的代謝和碳骨架形成至關重要[24]。TCA循環還涉及自由基和單線態氧的產生，這些自由基和單線態氧增強了類胡蘿卜素的生成[25]。

3 結論

本研究以新疆釀酒葡萄為材料，從中分離到6株粉紅色酵母菌株，都能在測試條件下合成類胡蘿卜素色素，但不同菌株產類胡蘿卜素的能力不同。在初步試驗中，產類胡蘿卜素最高的菌株是Y7（12.93 mg/L），經分類鑒定該菌株為粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）。生理生化檢測結果顯示，該菌株能利用葡萄糖、木糖等8種糖，甘油、檸檬酸、蘋果酸等物質可作為碳源，還能以硫酸銨、蛋白胨等作為氮源，但不能利用亞硝酸鈉，在以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源的液體培養基中，類胡蘿卜素產量最高。將丙酮浸提液在不同溫度、氧化劑、還原劑和酸度調節劑條件下處理，考察其胞外穩定性，結果顯示，低溫、蘋果酸和氫氧化鈉處理有利于維持其穩定性，不同濃度H2O2，亞硫酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸和檸檬酸鈉處理對其穩定性有一定的影響，但影響較小。結果表明，菌株Y7高產類胡蘿卜素具有廣泛的應用潛力，這對其他類胡蘿卜素和萜類產品的可持續工業生產具有重要意義。