齊整小核菌發酵產胞外多糖的培養基優化研究

張 麗，柳昊睿，趙馨儀，翟 麗，黃福山，黃正梅，王 敏*

（1.德州昂立達生物技術有限公司，山東 德州 253000；2.天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津 300457）

多糖（polysaccharide）是由糖苷鍵結合的糖鏈，至少要超過10個單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，目前已經成為分子生物學、食品科學、藥學等領域中的熱點研究內容之一[1-3]。隨著分子生物學的發展，人們逐級認識到糖及其復合分子具有極其重要的生物學功能，多糖具有抗凝血、抗感染、降血糖和降血脂等作用。多糖還可以控制細胞分裂和老化，與細胞間物質的運輸、癌癥的診斷與治療等都有著密切的關系[4-8]。

進入21世紀以來，利用生物技術生產聚合物和生物分子得到了長足的發展。與傳統化學技術相比，生物技術具有化石資源消耗少、反應條件溫和、環境友好等諸多優點。一些微生物最近被用于經濟地生產微生物多糖。硬葡聚糖是一種非離子型、水溶性多糖，是由絲狀真菌小核菌屬純培育發酵獲取，此中最典范的是齊整小核菌。小核菌多糖[9-11]擁有良好的水溶性、粘度、增稠性和穩定性[12]。近幾年來，國內外的研究者對微生物發酵產多糖的優化方面也做了大量研究，WANG L Y等[13]利用一株新菌株Kosakonia cowaniiLT-1進行發酵生產胞外多糖的研究。通過比較轉錄組學分析，了解蔗糖對胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）生物合成的影響。向蓉等[14]通過探究龍眼多糖添加量、發酵時間、接種量和初始pH對丁酸梭菌活菌量的影響，使總多糖含量比發酵前提高了464.65 mg/mL。FENG J等[15]通過優化發酵條件將靈芝的細胞內多糖產量提高到1.98 g/L。

考慮不同培養條件對齊整小核菌發酵產多糖量[14]的影響，從氮源、碳源、無機鹽等多個因素進行培養基的優化和設計。近年來，多糖被廣泛用于制藥、化工和保健品行業中，應用領域不斷擴大，需求量不斷增加[17-18]。隨著我國人民生活水平逐步的提高，多糖產品在國內市場的需求量也將逐漸增加。因此，對于怎樣提高多糖產量顯得尤為重要，首先利用Plackett-Burman法[19-20]可以快速有效的從許多因素中篩選出較為首要的幾個因素，其次利用最陡爬坡試驗及Box-Behnken試驗優化培養基的配方[21-23]。本研究將對齊整小核菌發酵產多糖的培養基中的碳源、氮源以及無機鹽進行優化，提高其胞外多糖產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌種

齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）ATCC 15205：保藏于天津科技大學微生物制藥研究室。

1.1.2 化學試劑

酵母浸粉、胰蛋白胨（均為生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；酵母膏、大豆蛋白胨、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；七水硫酸鎂、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖（均為分析純）：天津市耀華化工廠；磷酸氫二鉀、氯化鈉、硝酸鈉、氯化鉀、七水硫酸亞鐵、七水硫酸鋅、磷酸、乙醇（均為分析純）：天津化學試劑二廠。

1.1.3 主要培養基

基礎液體培養基：葡萄糖100.0 g/L，NaNO33.0 g/L，KH2PO41.3 g/L，檸檬酸0.7 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，維生素B13.3 mg/L，ZnSO4·7H2O 3.3 mg/L，酵母提取物1.0 g/L。pH=4.5～4.7（磷酸調節）。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，水1 000 mL，自然pH。

1.2 儀器與設備

LD5-10型低速離心機：北京醫用離心機廠；EMS-4B磁力攪拌器：天津歐諾儀器儀表有限公司；Agilent1200高效液相色譜系統：美國安捷倫公司；HYG-II回轉式恒溫調速搖床：上海欣蕊自動化設備有限公司；DL102型電熱鼓風干燥箱：天津市實驗儀器廠；754PC紫外-可見光分光光度計：上海菁花科技有限公司；FA2204B電子天平：上海精密科學儀器有限公司；ZHJH-1112超凈臺：上海智誠分析儀器制造有限公司；SS-325型全自動滅菌鍋：日本TOMY儀器有限公司；SAB-40E生物傳感儀：山東省科學院生物研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵產胞外多糖工藝流程及操作要點

配制培養基并滅菌→接種→液體發酵→過濾→濃縮→除蛋白、色素等→醇沉→離心并干燥→粗多糖

操作要點：

（1）接種：按5%接種量向發酵液中接入種子液。

（2）發酵：發酵液酸度4.5%～5.5%，接種溫度28～30 ℃；發酵溫度27～29 ℃培養時間66～70 h。

（3）過濾、濃縮：選用壓濾形式過濾除去發酵菌絲體等，收集澄清發酵液；選用蒸發提取等形式濃縮發酵液，提高多糖濃度；

（4）除蛋白、色素等：選用Servage法去除蛋白質；選用添加活性炭等形式去除色素等；

（5）醇沉：按照4倍體積添加無水乙醇，4 ℃靜置過夜。

（6）離心干燥：醇沉過夜后，5 000 r/min離心20 min，倒出有機溶劑收集沉淀部分冷凍干燥，得到粗多糖。

1.3.2 多糖含量測定方法

（1）葡萄糖標準曲線的繪制

準確稱取無水葡萄糖標準品10 mg，定容至100 mL容量瓶中，上下搖晃使之完全溶解，配成質量濃度0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。量取葡萄糖標準溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL于試管中，加去離子水至1.0 mL，再分別加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后加入5 mL濃硫酸搖勻，此過程需在冰水浴中進行。最后置于30℃水浴中反應30min，于波長490 nm測吸光度值，制作標準曲線。

（2）多糖的提取及含量測定

取培養至穩定期的齊整小核菌發酵液2 mL于離心管中，12 500 r/min離心5 min，取1 mL上清于EP管中，加4倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，進行醇沉，沉淀部分加10 mL水復溶，得到溶液①，取1 mL溶液①補水至10 mL得到溶液②。用Sevage法除蛋白，再用去離子水透析48 h，最后將多糖溶液在200～400 nm處進行掃描，收集在波長260 nm和280 nm處無吸收峰和無蛋白的組分，并采用苯酚-硫酸法測定多糖的含量[24-25]。

1.3.3 單因素試驗設計

（1）碳源篩選

以基礎液體培養基為基礎，分別考察質量濃度為100g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、甘露醇6種碳源對發酵效果的影響。于100 mL/250 mL搖瓶中接種對數期齊整小核菌液5%，置于28 ℃培養箱中220 r/min振蕩培養5 d，按苯酚硫酸法測定多糖含量，每種碳源做三組平行。

（2）氮源篩選

在碳源篩選的基礎上，分別采用胰蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏、大豆蛋白胨、蛋白胨作為氮源，每種氮源含量設定為6 g/L，其余步驟與測定碳源相同，根據多糖產量，選擇合適的氮源種類。

1.3.4 Plackett-Burman試驗設計

按照1.3.3中對碳源和氮源種類的篩選結果和相關文獻結論，分別以葡萄糖和胰蛋白胨為碳、氮源，結合影響齊整小核菌發酵狀態主要的無機鹽NaNO3、KCl和FeSO4，并進一步結合培養基必需的MgSO4和K2HPO4等7個因素，采用PB試驗篩選培養基組分中對于齊整小核菌發酵所得期望值影響顯著的因素。以篩選培養基各成分中對多糖產量影響最為顯著的若干因子。

1.3.5 最陡爬坡試驗與Box-Behnken試驗設計

在上述試驗結果的基礎上，進行最陡爬坡試驗方案的設計，并進一步進行Box-Behnken設計試驗，依據此方案進行試驗，根據結果進行分析從而獲得最優的培養基配方。

1.3.6 統計分析

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行Plackett-Burman試驗和Box-Behnken響應面優化試驗設計，運用該軟件的數據分析功能進行數據分析，建立回歸模型，并對建立的模型進行驗證，利用Origin 8.5和SPSS 20.0軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 碳源篩選結果

在基礎液體培養基的基礎上，分別采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇和果糖作為碳源，把每種碳源含量設定為100 g/L。制備培養基，檢測每種碳源發酵條件下胞外多糖產量，培養基裝液量為100 mL/250 mL，再分別以5%的接種量接入種子液，200 r/min、28 ℃培養48 h，進行搖瓶發酵。每種碳源分別做3組平行試驗，測定多糖產量，試驗結果見圖1。由圖1可知，當葡萄糖作為碳源時，多糖產量最高，為（16.54±1.16）g/L。因此，最適碳源為葡萄糖。

圖1 不同碳源對齊整小核菌多糖產量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on polysaccharide yield of Sclerotium rolfsii

2.2 氮源篩選結果

在碳源篩選的基礎上考察氮源種類對齊整小核菌產胞外多糖的影響。以基礎培養基為初始培養基，在其他組分不變的情況下，分別采用6 g/L胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏、大豆蛋白胨作為氮源，替換培養基中的氮源，再分別以5%的接種量接入種子液，200 r/min、28 ℃培養48 h，進行搖瓶發酵。每種氮源培養基平行3次試驗，測定每種氮源培養基的多糖產量，以選擇適合的氮源種類，結果見圖2。由圖2可知，當胰蛋白胨作為氮源時，多糖產量最高，為17.23 g/L。因此，最適氮源為胰蛋白胨。

圖2 不同氮源對齊整小核菌多糖產量的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on polysaccharide yield of Sclerotium rolfsii

2.3 Plackett-Burman 設計試驗結果

按照1.3.4的方法，采用Plackett-Burman試驗，篩選培養基組分（葡萄糖、胰蛋白胨、NaNO3、KCl、K2HPO4、MgSO4和FeSO47個因素分別以X1～X7表示，以及X8～X11四個虛擬項）中對于齊整小核菌發酵所得胞外多糖期望值影響顯著的因素。其中各因素的水平設置及結果分析分別如表1、表2所示，對所有的試驗結果進行線性回歸分析得到的多元一次方程為：Y=15.40+2.92X1+0.069X2+2.51X3-0.23X4-0.35X5-2.04X6-0.69X7。

表1 Plackett-Burman試驗的因素與水平Table 1 Factors and level of Plackett-Burman experiments

表2 Plackett-Burman試驗方案及結果Table 2 Scheme and results of Plackett-Burman experiments

續表

用常規的F檢驗方法分析模型，齊整小核菌多糖產量影響因素的主效應分析結果如表3所示。由表3可知，線性模型P=0.036 5整體達到顯著水平（P＜0.05），表明該模型顯著可靠，可以較好地描述試驗影響因素與多糖產量之間的關系。發酵培養基中對齊整小核菌多糖產量的影響效應大小依次為：葡萄糖、NaNO3、MgSO4、FeSO4、K2HPO4、KCl、胰蛋白胨。其中葡萄糖、NaNO3和MgSO4均是顯著影響因子（P＜0.05）。因此，根據本試驗結果確定對葡萄糖、NaNO3和MgSO4進行最陡爬坡路徑設計。

表3 Plackett-Burman試驗的回歸分析結果Table 3 Regression analysis results of Plackett-Burman experiments

2.4 最陡爬坡試驗

通過PB試驗結果證實顯著影響多糖產量的因素有葡萄糖、NaNO3和MgSO4。進一步通過最陡爬坡路徑試驗，優化葡萄糖、NaNO3、MgSO4添加量的水平，獲得最佳培養基配方，其中試驗方案設計及結果如表4所示。

表4 最陡爬坡路徑試驗設計及結果Table 4 Design and results of the steepest climbing path experiments

結果顯示，葡萄糖和NaNO3沿最速上升方向，MgSO4沿最速下降方向按照設計的濃度梯度變化。1～6組多糖產量呈現先上升后下降的變化趨勢，當培養基中葡萄糖含量為140 g/L、NaNO3含量為3.32 g/L和MgSO4含量為0.92 g/L時，對應的多糖產量最多為22.57 g/L，為最大響應值區域。

2.5 Box-Behnken試驗設計及結果

3個重要因子的最適濃度范圍確定后，以葡萄糖（A）140 g/L、NaNO3（B）3.32 g/L、MgSO4（C）0.92 g/L為中心點，進行3因素3水平的響應面分析試驗，多糖產量（Y）的Box-Behnken試驗設計測定結果見表5。

表5 Blackett-Burman試驗設計及結果Table 5 Design and results of Blackett-Burman experiments

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表5的數據進行多元回歸擬合，得到該模型的二次擬合回歸方程為：

Y=17.03+3.26A+2.58B-1.71C+1.17AB-0.81AC+0.28BC-1.28A2-0.49B2-0.44C2，其中Y為多糖產量的預測值，A、B、C分別是葡萄糖、NaNO3、MgSO4質量濃度的編碼水平。AB、AC、BC分別是葡萄糖和NaNO3含量、葡萄糖和MgSO4、NaNO3和MgSO4對小核菌多糖產量交互影響的編碼水平，響應面試驗方差分析結果見表6。

表6 Blackett-Burman試驗回歸分析結果Table 6 Regression analysis results of Blackett-Burman experiments

如表6所示，該模型的一次項A、B和C對結果影響顯著（P＜0.05），交互項AB以及二次項A2對結果影響極顯著（P＜0.01）。此外葡萄糖和NaNO3含量的變化對小核菌多糖產生的交互作用影響較大。該模型選取95%的置信度，二次多項式方差分析結果表明，模型極顯著（P＜0.01），回歸結果比較理想，失擬項沒有達到顯著水平（P＞0.05），表明非試驗因素對結果影響有限，所擬合的模型可靠性很高，該模型可以用于小核菌多糖培養基優化的分析和理論預測。

除上述小核菌多糖產量預測值與真實值比對外，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件來繪制三維響應面圖及對應的等高線圖，將該模型中單一變量之間相互作用對小核菌多糖產量進行表征。不同影響因子之間交互作用的三維曲面圖與相應的等高線圖見圖3。

圖3 各因素交互作用對多糖產量影響的響應面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on exopolysaccharide yield

2.6 最佳胞外多糖產量及模型驗證

用Design-Expert 8.0.6.1軟件中Box-Behnken軟件對響應面模型進行典型性分析，求得的響應值理論值為23.18 g/L。此時可得發酵培養基的最優配方為葡萄糖135.96 g/L、NaNO33.80g/L、MgSO40.39g/L，胰蛋白胨6.96g/L、KCl0.5g/L、K2HPO41.34 g/L、MgSO40.39 g/L和FeSO40.017 g/L。按照實際可操作條件，將配方調整為葡萄糖136 g/L、NaNO33.8 g/L、MgSO40.4 g/L，胰蛋白胨7 g/L、KCl 0.5 g/L、K2HPO41.3 g/L和FeSO40.1 g/L。按照優化后的參數進行發酵培養，測得小核菌多糖產量實際值為（23.76±1.05）g/L，同初始培養基相比提高了54.42%，與預測值誤差為2.5%，可見該模型能夠較好的預測小核菌多糖的實際產值。

3 結論

通過對培養基進行優化設計試驗，研究了提高齊整小核菌多糖產量的方案，依次通過單因素試驗考察不同碳源、不同氮源和無機鹽對于齊整小核菌產多糖培養基的影響，并通過Plackett-Burman試驗設計、最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗設計等獲得最優培養基配方。最終得到的小核菌多糖最優培養基配方為葡萄糖136 g/L、NaNO33.8 g/L、MgSO40.4 g/L，胰蛋白胨7 g/L、KCl 0.5 g/L、K2HPO41.3 g/L和FeSO40.1 g/L，此培養基得到的多糖產量為（23.76±1.05）g/L，相比原始培養基提高54.42%。