石花清香型白酒大茬和二茬酒醅真菌類群的比較

黃 怡，鄧曉茜，鐘吉安，劉忠軍，侯強川，郭 壯*

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市釀酒生物技術與應用企校聯合創新中心，湖北 襄陽 441053；3.湖北省石花釀酒股份有限公司，湖北 襄陽 441705）

白酒根據香型主要分為12種，清香型白酒是其中的一種，以山西汾酒為代表。白酒不僅歷史文化悠久，同時其獨特的生產發酵工藝還賦予了白酒以酯類為主體的復合香味[1-2]。清香型白酒的主體香味物質是乙酸乙酯和乳酸乙酯，主要合成途徑分別是酵母菌代謝與酸和醇在酯化酶作用下的化學合成，這兩種途徑都需要微生物的參與[3]。清香型白酒發酵階段包括大茬發酵和二茬發酵兩個階段[4]，不同發酵階段的發酵工藝均存在差異。因此，不同發酵條件下酒醅中微生物群落結構存在差異，對酒的品質也會造成一定的影響。

高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術具有成本低、通量高和結果準確的優勢[5]，廣泛應用于渣豆醬[6]、豆豉[7]、大頭菜[8]、酸奶[9]以及各種香型白酒[10-12]發酵基質的微生物類群解析。陳雪等[13]對陜西鳳香型白酒發酵過程中的微生物群落結構進行研究發現，發酵過程中共檢測出216個屬，其中細菌屬183個、真菌屬33個，酒醅中微生物真菌以Naumovozyma、根霉屬（Rhizopus）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Canndida）、Pseudeurotium、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、畢赤酵母屬（Pichia）和酵母屬（Saccharomyces）為主，細菌以乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、片球菌屬（Pediococcus）和鏈霉菌屬（Streptomyces）為主；張雙燕等[14]對北京某清香型酒廠大曲中微生物多樣性進行研究發現，細菌中優勢菌是乳酸菌，真菌中優勢菌屬是Canndida、Aspergillus、毛霉屬（Mucor）、維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）等；雷振河[15]分析了山西清香型白酒大曲及酒醅中微生物多樣性，結果發現大曲中優勢真核微生物主要包括Aspergillus、Thermoascus、Rhizopus、嗜熱真菌屬（Thermomyces）和Canndida；酒醅中真菌主要包括Canndida和Pichia。這些研究均表明不同地區清香型白酒釀造微生物類群存在一定的差異，加之生態環境和制作工藝存在差異，其生產的白酒品質與風格也會有所差別。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術對湖北省石花釀酒股份有限公司的清香型白酒大茬和二茬酒醅中真菌多樣性及群落結構進行比較分析，以期更加全面地了解大茬和二茬酒醅中真菌類群，為湖北襄陽地區釀酒微生物資源挖掘和后續白酒的發酵調控提供一定理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

酒醅：湖北省石花釀酒股份有限公司釀造車間。以高粱為主要原料，經粉碎、高溫潤糝、糊化和出甑加漿后，按照糧食干質量的10%接入低溫大曲，入缸發酵28 d，此時所取樣品即為大茬酒醅。大茬酒醅出缸拌輔料裝甑蒸餾后，加入等質量低溫大曲入缸發酵21 d，此時所取樣品即為二茬酒醅。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：德國QIAGEN公司；Fast Pfu Buffer、Fast Pfu Fly DNA聚合酶（酶活5 U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix、5×TransStartTM：北京全式金生物技術有限公司；引物ITS4R/ITS3F、6×Loading Buffer：武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Veriti 96孔梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；Fluor Chem FC3型化學發光凝膠成像系統：美國Protein Simple公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；CR21N高速冷凍離心機：日本HITACHI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

于湖北省石花釀酒股份有限公司釀造車間選取20個地缸，其中10個為大茬發酵缸，10個為二茬發酵缸，地缸深度均為1.2 m，使用土壤采樣器深入酒醅表面約0.6 m處取樣品約500 g，將大茬酒醅樣品依次編號為DC1～DC10，二茬酒醅樣品依次編號為EC1～EC10。

1.3.2 宏基因組DNA提取、PCR擴增及Illumina MiSeq高通量測序

參照試劑盒方法提取酒醅的宏基因組DNA，以其為模板，采用引物ITS4R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS3F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）對酒醅中真菌的內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）2區基因序列進行PCR擴增，PCR擴增體系及擴增條件參照文獻[16]。采用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測，將檢驗合格的PCR擴增產物送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 序列質控和生物信息學分析

參照文獻[17]中的方法進行質控，使用QIIME（version 1.9.1）分析平臺[18]對質控后的序列進行分析。采用PyNAST[19]軟件將序列對齊，按97%和100%相似性構建操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣[20]，然后對每個OTU的代表性序列利用UNITE數據庫進行同源性比對[21]。

1.3.4 多元統計分析及圖表繪制

本研究對最小測序深度下的發現物種數和香農指數等α多樣性指標進行分析，同時基于UniFrac距離[22]使用主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）對2種酒醅的真菌類群進行β多樣性分析。使用曼-惠特尼秩和（Mann-Whitney）檢驗對單個指標在2種酒醅中的差異性進行分析，使用多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對2種酒醅樣品真菌群落結構的差異性進行分析。使用Excel 2016進行數據處理，使用R軟件（v3.6.3）的Ggpubr和ggplot2軟件包繪制小提琴圖，使用Ggplot2和Reshape2軟件包繪制氣泡圖，使用Waterfall軟件包繪制瀑布圖，使用Origin 8.5繪制其他圖，部分數據采用“平均值±標準差”形式進行展示。

2 結果與分析

2.1 大茬及二茬酒醅樣品間α多樣性分析

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術對20個酒醅樣品檢測共產生988 381條有效序列，平均每個樣品的有效序列為49 419條。在97%的相似度下，10個大茬酒醅樣品劃分了（2 297±197）個OTU，10個二茬酒醅樣品劃分了（1 828±398）個OTU。使用小提琴圖對2種酒醅樣品的α多樣性進行比較分析，結果見圖1。

物種多樣性指數和香農指數分別用來評估樣本中微生物的豐度和多樣性[23]。由圖1可知，當測序深度達到34 010條序列時，大茬和二茬酒醅真菌類群發現物種數分別為（1 796±115）種和（1 497±107）種，香農指數分別為4.97±0.50和3.70±0.27，經Mann-Whitney檢驗發現兩者差異均極顯著（P＜0.001），這說明大茬酒醅中真菌的豐富度和多樣性均高于二茬酒醅。

圖1 酒醅樣品發現物種數（A）和香農指數（B）比較的小提琴圖Fig.1 Violin diagram of comparison of observed species number (A)and Shannon index (B) of fermented grains samples

2.2 大茬及二茬酒醅樣品間β多樣性分析

β多樣性可反映不同環境中物種組成的相異性或物種沿環境梯度的更替速率[29]。基于UniFrac距離的加權和非加權主坐標分析對20個酒醅樣品進行空間排布，結果見圖2。

由圖2A可知，將真菌相對含量和遺傳進化關系均納入分析范疇時，第一主成分和第二主成分的累計方差貢獻率高達95.02%，大茬酒醅樣本分布在第一、三和四象限，二茬酒醅樣本集中分布在第二象限，2種樣本間無交疊現象。由圖2B可知，在僅考慮真菌類群遺傳進化關系而不考慮各真菌相對含量時，第一主成分的方差貢獻率為17.24%，第二主成分的方差貢獻率為5.83%，大茬酒醅樣本分布在第二和第三象限，二茬酒醅樣本分布在第一和第四象限。由此可定性認為2種酒醅樣本間真菌群落存在較大差異，且大茬酒醅真菌類群的組間差異要大于二茬酒醅。本研究進一步采用歐式距離對2種酒醅群落結構組內差異進行計算，結果見圖3。

圖2 基于加權（A）和非加權（B）的UniFrac距離酒醅樣品的主坐標分析Fig.2 Principal coordinate analysis of fermented grains samples based on weighted (A) and unweighted (B) UniFrac distance

由圖3可知，大茬酒醅組內各樣本間的歐式距離為0.044±0.010，而二茬酒醅組內各樣本間的歐式距離為0.010±0.002，這可定量證明大茬酒醅樣本組內差異性要比二茬酒醅樣本大。采用MANOVA檢驗亦發現，大茬酒醅樣品和二茬酒醅樣品真菌群落結構整體上存在極顯著差異（P＜0.001），這與主坐標分析結果一致。

圖3 基于歐式距離酒醅樣品真菌群落結構組間差異分析Fig.3 Analysis of between-group differences in fungal community structure of fermented grains samples based on Euclidean distance

2.3 基于OTU水平酒醅樣品真菌類群分析

經兩步UCLUST劃分共得到17 543個OTU，將所有樣品中都存在的某一OTU定義為核心OTU。對樣品中OTU出現次數和核心OTU相對含量進行分析，結果見圖4。

由圖4A可知，本研究中核心OTU共有134個，僅占總OTU數的0.76%，包含序列數856 136條，占總序列的86.62%。由此可見，大茬酒醅和二茬酒醅樣品中共有大量的核心OTU真菌類群。由圖4B可知，平均相對含量＞1.00%的核心OTU有6個，包含序列數占總序列數的68.85%，但OTU數僅占總OTU數的0.03%，分別為OTU6804（17.41%）、OTU4028（38.25%）、OTU4343（1.04%）、OTU1926（1.01%）、OTU1903（1.01%）和OTU12648（10.13%），其中OTU6804隸屬于熱子囊菌屬（Thermoascus），OTU4028和OTU4343隸屬于酵母屬（Saccharomyces），OTU1926隸屬于曲霉屬（Aspergillus），OTU1903隸屬于漢遜酵母屬（Hanseniaspora），OTU12648隸屬于覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis），由此可見Saccharomyces、Thermoascus、Aspergillus、Hanseniaspora和Saccharomycopsis是襄陽地區清香型白酒酒醅中的優勢真菌。值得一提的是，有23個OTU僅存在于大茬酒醅樣品中，有1個OTU僅存在于二茬酒醅樣品中，其累計包含序列占總序列數的比例分別為2.36%和0.04%，其中17個鑒定為散囊菌目（Eurotiales）的分類單元，4個鑒定為酵母菌目（Saccharomycetales）的分類單元，1個鑒定為散囊菌綱（Eurotiomycetes）的分類單元，2個僅能鑒定為Ascomycota的分類單元。

圖4 酒醅樣品OTUs出現次數階梯圖（A）和核心OTUs相對含量瀑布圖（B）Fig.4 Ladder plot of OTUs occurrence frequency (A) and waterfall plot of the relative content of core OTUs (B) of fermented grains samples

2.4 基于門和屬分類學地位酒醅樣品的真菌類群分析

將平均相對含量＞1.00%的真菌門或屬定義為優勢真菌門或屬，將平均相對含量＜1.00%的門或屬歸并為“others”，將不能鑒定到門或者屬水平的序列歸并為“unclassified”。本研究中鑒定的真菌類群為3個門和32個屬，其中優勢門僅1個，優勢屬有5個。基于門和屬水平的2種酒醅真菌類群的分析結果見圖5。

由圖5A可知，大茬酒醅和二茬酒醅的優勢真菌門均為子囊菌門（Ascomycota），平均相對含量分別為99.82%和99.97%。經Mann-Whitney檢驗發現，采集的2種酒醅樣品在門水平上差異均不顯著（P＞0.05）。有研究表明，子囊菌門不僅是清香型酒醅中優勢真菌種群[24]，同樣也是濃香型[25]、醬香型白酒[26]及多種發酵食品中的主要真菌種群。

由圖5B可知，大茬酒醅中平均相對含量＞1.00%的真菌屬分別為Thermoascus（33.77%）、Saccharomycopsis（22.60%）、Saccharomyces（13.51%）、Leiothecium（9.34%）、Aspergillus（4.19%）和Hanseniaspora（1.62%），二茬酒醅中為Saccharomyces（84.64%）、Saccharomycopsis（1.42%）和Thermoascus（1.30%）。經Mann-Whitney檢驗發現，2種酒醅樣品中優勢真菌屬含量均呈現極顯著差異（P＜0.001）。由圖5B亦可知，Thermoascus和Saccharomycopsis平均相對含量在大茬酒醅中顯著偏高（P＜0.01），而Saccharomyces平均相對含量在二茬酒醅中顯著偏高（P＜0.01）。襄陽地區大茬酒醅和二茬酒醅樣品真菌類群存在較大差異的原因，可能與原料和制作工藝的不同有關[27]。

圖5 基于門（A）和屬（B）分類學地位酒醅樣品的真菌類群分析Fig.5 Fungal community analysis of fermented grains samples based on the taxonomic status of phylum (A) and genus (B)

大茬酒醅和二茬酒醅的發酵周期一般為21～28 d，大茬酒醅發酵溫度遵循“前緩升、中挺、后緩落”的原則，由于二茬酒醅酸度較大，發酵溫度和大茬酒醅有所差別，一般遵循“前緊、中挺、后緩落”的原則。有研究表明，霉菌是具有糖化力的主要微生物，使酒曲具有發酵和生香的特殊香味[28]。賈麗艷等[29]研究了山西杏花村汾酒大茬酒醅和二茬酒醅發酵過程中的真菌群落結構，結果發現在發酵過程中真菌的種類和數量隨著發酵時間和環境的影響而變化，其中大茬酒醅發酵過程中Saccharomycopsis、Saccharomyces和Candida為優勢種群，二茬酒醅中Saccharomycopsis、Hanseniaspora、青霉屬（Penicillium）、Aspergillus、范氏酵母屬（Vanderwaltozyma）和有孢圓酵母屬（Torulaspora）為主要優勢菌群，該研究與本研究結果有所差別，可能是由于原料、制作工藝和地域氣候環境等綜合因素不同造成的。

3 結論

采用Illumina MiSeq高通量測序技術對石花清香型白酒大茬和二茬酒醅中真菌的群落結構和多樣性進行分析。結果表明，大茬酒醅的發現物種數和香農指數與OTU數較高，豐富度和多樣性均高于二茬酒醅，且2種酒醅真菌類群存在明顯的差異。2種酒醅共有大量的核心OTU（134個）。在門水平上，2種酒醅的優勢真菌門均為子囊菌門（Ascomycota），平均相對含量分別為99.82%和99.97%。在屬水平上，大茬酒醅中優勢真菌屬為熱子囊菌屬（Thermoascus）（33.77%）、腹膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（22.60%）、酵母屬（Saccharomyces）（13.51%）、Leiothecium（9.34%）曲霉菌屬（Aspergillus）（4.19%）和漢遜酵母屬（Hanseniaspora）（1.62%），二茬酒醅中優勢真菌屬為（Saccharomyces）（84.64%）、Saccharomycopsis（1.42%）和Thermoascus（1.30%）。由此可見，雖然共有部分真菌類群，但2種酒醅真菌群落結構存在明顯的差異。