賒店老酒大曲中可培養真菌的分離和鑒定

劉延波，張 達，盧倩倩，韓素娜，王 賢，孫西玉，6，潘春梅*

（1.河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院（酒業學院），河南 鄭州 450046；2.河南仰韶酒業有限公司 博士后科研工作站，河南 澠池 472400；3.河南牧業經濟學院 河南省白酒風格工程技術研究中心，河南 鄭州 450046；4.河南牧業經濟學院 鄭州市白酒釀造微生物技術重點實驗室，河南 鄭州 450046；5.賒店老酒股份有限公司，河南 社旗 473300；6.河南張弓老酒酒業有限公司，河南 寧陵 476733）

白酒是我國的傳統酒種，以糧谷為主要原料，發酵而成的蒸餾酒，歷史悠久，在漫長的發展過程中形成了獨特的工藝和種類豐富的風味[1]。白酒釀造過程中所產生的獨特風味是多種微生物共同作用的結果，而大曲是發酵過程中微生物的主要來源之一[2]。大曲不僅作為原料，也起到網羅環境中微生物的作用，是白酒的釀造動力源，有利于釀造過程中生成酶和風味物質成分[3]。同時大曲中含有豐富的兼性可培養微生物，為白酒釀造提供了大量產香微生物，對白酒中酯類、醛類、醇類等有機物的形成有著直接作用[4]，并且對白酒的風味形成也至關重要[5]。

大曲中的微生物主要有細菌和真菌，真菌對于大曲的質量以及白酒風味的形成具有重要的作用。酵母菌是大曲主要功能微生物菌群之一，在大曲酒的發酵過程中起主導作用[6]。酵母不僅能發酵糖類產生乙醇，而且能代謝產生豐富的風味成分，如生香釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和假絲酵母（Candida）等；而畢赤酵母（Pichia pastoris）在不同發酵條件下，可以產生醇、酯、酸等多種風味物質，從而影響白酒的產品味感和風味特征[7-8]。白酒發酵過程中酵母菌具有多樣性，不同種類酵母菌的耐熱性、耐酒精性、耐酸性和發酵力也都不同[9]。

大曲中的霉菌不僅是形成曲表穿衣、保證曲體排水順暢從而避免大曲酸敗的主要菌類[10]，而且賦予大曲糖化、液化、蛋白分解等各種水解能力及酯化能力，對白酒的風格形成起到了重要作用[11]。在發酵伊始，霉菌所產生的酶在發酵過程中有糖化的作用，將淀粉質原料在一定條件下全部或部分轉化為葡萄糖等可發酵性糖，以供酵母菌和細菌利用[12]，其次大曲中的霉菌可產生豐富的淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、酯化酶、果膠酶等酶系，不同的霉菌所產生的酶不同，這些酶系在釀酒的過程中產生積極的作用[13]。

由于微生物的各種生理代謝功能只能在可培養的條件下研究，純種培養技術可以得到微生物菌株，再對其形態結構和遺傳特性進一步認識，有利于豐富微生物的物種多樣性[14]。目前采用可培養技術對中原濃香型白酒大曲微生物物種多樣性的研究較少，本研究通過傳統微生物培養技術從賒店老酒大曲中得到純種真菌菌株，對獲得的純種菌株進行菌種鑒定，最后構建系統發育樹對大曲中酵母菌和霉菌進行整體分析，以便于準確認識賒店老酒大曲可培養真菌多樣性，豐富了中原地區濃香型白酒的真菌菌種資源庫，為真菌資源的有效開發和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

大曲：河南賒店老酒股份有限公司。

1.1.2 主要試劑

蔗糖、葡萄糖、無水乙醇、硫酸鎂、瓊脂：天津市科密歐化學試劑有限公司；氯化鈉：西隴化工股份有限公司；磷酸二氫鉀、50%甘油、硝酸鈉、磷酸氫二鉀：天津市德恩化學試劑有限公司；氯化鉀：鄭州派尼化學試劑廠；硫酸亞鐵：國藥集團化學試劑有限公司；酵母浸粉：英國Oxoid公司；酵母膏、蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；氯霉素、鏈霉素：北京博奧拓達科技有限公司；1.0%瓊脂糖：廈門太陽馬生物工程有限公司；0.5×三羥甲基氨基甲烷硼酸電泳緩沖液（Tris-borate electrophoresis buffer，TBE）：廣州賽國生物科技有限公司；溶壁酶（酶活200 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；SanTaqPCRMix預混液：北京康為世紀生物科技有限公司；酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DNA Marker：天根生化科技（北京）有限公司；引物：上海英駿生物技術有限公司。實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

豆芽汁富集培養基：黃豆芽10 g，水100 mL，煮沸30 min，過濾后補足失水，加水400 mL，葡萄糖25 g，121 ℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，瓊脂20 g/L，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，115 ℃滅菌20 min。

PDA液體培養基：去皮馬鈴薯200 g/L，切成小塊，加水1 000 mL加熱攪拌30 min，過濾除去固形物并補足失水，加入葡萄糖20 g，加熱充分溶解，121 ℃滅菌20 min。

高鹽查氏培養基：硝酸鈉2 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，氯化鈉60 g/L，蔗糖30 g/L，瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌20 min

孟加拉紅培養基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，瓊脂20 g/L，氯霉素0.1 g，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；ZQLY-300S恒溫培養搖床：上海精宏試驗設備有限公司；MQD-B3R振蕩培養箱、DHP-9162電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；LQ-C3002電子天平：上海瑤新電子科技有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；3-18KS高速冷凍離心機：美國Sigma公司；DYY-2C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Labcycler梯度聚合酶聯式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國SensoQuest公司；WD-9403F紫外分光光度儀、CX31型生物顯微鏡：奧林巴斯（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 真菌菌株的分離純化

從賒店老酒優質大曲的曲心和曲皮按照1∶1的比例，分別取樣5 g。并混合研磨成粉[16]。取混合均勻的曲粉10 g（無菌條件下）于90 mL無菌水中150 r/min、28 ℃振蕩30 min。待混合液靜置后，取5 mL上清液與100 mL豆芽汁富集培養基混合均勻，28 ℃、200 r/min搖床培養48 h。分別取10-2～10-6梯度稀釋液100 μL于YEPD培養基及PDA培養基（含2%鏈霉素）涂布，每個梯度三個平行，其中YEPD平板培養基于28 ℃條件下培養48 h，PDA培養基于28 ℃條件下培養3～5 d。挑取長勢良好的單菌落接種到PDA培養基固體平板中，反復劃線純化獲得純菌株。觀察稀釋涂布平板分離得到的單菌落，根據菌落特征及鏡檢結果，挑選相應的單菌落反復接種3～4次直至獲得純種菌落。對實驗過程中的特殊菌落做好特征記錄。將純化后的菌落制成種子液，與50%滅菌甘油按1∶1（V/V）注入凍存管混勻，保存在-20 ℃冰箱。

1.3.2 形態學觀察

用PDA培養基和孟加拉紅培養基篩選霉菌，用YEPD培養基篩選酵母，對分離得到的酵母菌和霉菌觀察并記錄菌落形狀、顏色、透明度、邊緣、質地、濕潤程度等菌落特征，以及霉菌菌株的分生孢子梗著生情況、孢子形態與顏色等特征，并對所有菌株初步分類，結合鏡檢結果將形態和培養特征高度一致的歸為一類，對特殊形態的菌株特別標記。

1.3.3 分子生物學鑒定

將所獲得的真菌接種于PDA液體培養基，28℃、120r/min條件下振蕩培養約18 h，取1 mL菌液于已滅菌的離心管中離心，得到菌體沉淀后，按照Ezup柱式酵母基因組DNA提取試劑盒說明書提取真菌基因組DNA，并于1%瓊脂糖凝膠電泳觀察目的基因條帶，所獲基因組DNA保存在-20 ℃冰箱中備用。

以提取的基因組DNA為模板對分離酵母菌株的26S rDNA（D1/D2）區基因序列進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL，其中SanTaqPCRMix預混液25 μL、通用引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）各2μL、DNA模板2μL、雙蒸水（ddH2O）19 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。

以提取的基因組DNA為模板對分離霉菌菌株的18S rDNA基因序列進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL，其中SanTaqPCR Mix預混液25 μL、通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）各2 μL，DNA模板2 μL、雙蒸水（ddH2O）19 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性6 min，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸120 s，30個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。

取3 μL擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產量和特異性，電泳條件：電壓110 V，時間30 min，將PCR產物送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

將測序所得的特定真菌菌株序列結果，在美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上通過局部序列排比檢索基本工具（basic local alignment search tool，BLAST）程序進行同源序列比較與分析，初步確定受試菌株的分類地位，用MEGA 7.0軟件進行多序列比對，采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹[15]。

2 結果與分析

2.1 真菌的分離純化和菌落形態觀察

從賒店老酒優質大曲中分離純化得103株霉菌，根據菌落形態特征的不同將霉菌分為35類，編號為LQMJ1～LQMJ35，部分菌株菌落的形態及鏡檢結果見圖1，霉菌菌落特征描述結果見表1。分離純化得到45株酵母菌，編號為SDJM1～SDJM45，部分酵母代表菌株的菌落特征及鏡檢圖結果見圖2、菌落形態具體描述結果見表2。

表1 賒店老酒大曲可培養霉菌的形態特征Table 1 Morphological characteristics of culturable molds in Shedianlaojiu Daqu

表2 分離酵母菌的形態特征Table 2 Morphological characteristics of isolated yeasts

圖1 部分霉菌菌落及孢子形態Fig.1 Colonies and spore morphology of some molds

圖2 部分酵母菌的菌落及細胞形態Fig.2 Colonies and cell morphology of some yeasts

2.2 真菌分子生物學鑒定

2.2.1 酵母菌PCR擴增結果

通過酵母DNA提取試劑盒獲得酵母DNA，用引物NL1/NL4對酵母26S rDNA序列擴增，瓊脂糖凝膠結果見圖3，都得到600 bp大小片段，與預期產物大小一致。

圖3 部分酵母基因片段的PCR擴增產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification products of some yeasts gene fragments

2.2.2 霉菌PCR擴增結果

利用酵母試劑盒提取霉菌DNA，用引物ITS1和ITS4對霉菌進行18S rDNA序列擴增，瓊脂糖凝膠結果見圖4，都得到550 bp大小片段，均與預期產物大小一致。

圖4 部分霉菌基因片段的PCR擴增產物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of PCR amplification products of some molds gene fragments

2.3 分離菌株的系統發育樹分析

根據所得26S rDNA基因序列和18S rDNA基因序列，在NCBI上通過BLAST程序進行同源序列比較與分析，構建酵母菌及霉菌系統發育樹，結果分別如圖5和圖6所示，結合45株酵母的菌落形態觀察結果和細胞形態觀察結果，確認從賒店老酒大曲中分離得到6株酵母菌，分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、異常威克漢姆酵母（Wicker hamomyces anomalus）、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）及光滑假絲酵母（Candida glabrata）。35株霉菌經18S rDNA鑒定得到4個霉菌菌屬，分別為根霉屬（Rhizopus）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、曲霉屬（Aspergillus）和毛霉屬（Mucor）。

圖5 基于26S rDNA序列45株酵母菌的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 45 yeasts based on 26S rDNA sequences

圖6 基于18S rDNA序列35株霉菌系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of 35 molds based on 18S rDNA sequences

2.4 真菌的種群數量分析

6種酵母所占總量比例見圖7a。由圖7a可知，45株酵母中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）占71%、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）占2%、發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）占9%、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）占5%、光滑假絲酵母（Candida glabrata）占11%、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）占2%。4種霉菌屬所占總量比例見圖7b。由圖7b可知，篩選的霉菌經DNA分子鑒定最終確認根霉屬（Rhizopus）和橫梗霉屬（Lichtheimia）數量較多，其中根霉屬（Rhizopus）占37%、橫梗霉屬（Lichtheimia）占33%、曲霉屬（Aspergillus）占18%、毛霉屬（Mucor）占12%。

圖7 6種酵母（a）及4種霉菌屬（b）所占總量比例Fig.7 Proportion of 6 kinds of yeasts(a)and 4 kinds of molds(b)in total

3 討論

白酒釀造處于一個開放的環境，相對于其他酒種具有一定的區域性，不同地區的微生物資源不同，釀造出的白酒風格也不同。張杰等[17]在宋河酒廠高溫大曲中分離鑒定出假絲酵母（Candida）、三角酵母（Trigonopsis）、紅冬孢酵母（Rhodos poridium）等3個酵母屬。羅惠波等[18]從瀘州老窖濃香大曲中分離得出釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、德巴利氏酵母（Debaryomyces）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和鎖擲酵母（Sporidiololus pararoseus）4個酵母屬。劉宏媛等[19]以瀘州老窖大曲為樣本，使用傳統培養分離方法得到2株酵母菌，經過菌落特征觀察和顯微鏡觀察后，利用Biolog微生物自動鑒定系統對2株酵母進行鑒定，確認它們分別為佛羅倫薩結合酵母（Zygosaccharomyces florentine）和伯頓絲孢畢赤酵母（Pichia burtoni）。徐占成等[20]以劍南春大曲為研究對象，利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳研究得出劍南春大曲中酵母主要分布在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、漢遜酵母（Hansenula）、假絲酵母（Candida）和畢赤酵母（Pichia）5個屬。本實驗中發現的6個酵母菌屬與其他濃香型白酒相比處于較高水平，由此可以看出，不同地區白酒大曲酵母菌的種類有很大區別，正因為這些不同，構成了各個白酒品牌的風味特色。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是大曲中分布最為廣泛的酵母菌屬，能夠將糟醅中的淀粉發酵為酒精，在白酒發酵過程中起著至關重要的作用。企業從釀酒生產中分離篩選出功能突出的產酒酵母強化發酵，能夠節約糧食、提高出酒率、降低成本[21]。除了生產酒精外，酵母菌的代謝作用還能夠賦予白酒層次復雜的香味[22-23]。產酯酵母（產香酵母）的種類和數量對白酒的質量有著極大的影響，產酯酵母也成為了近年來白酒功能菌的研究熱點。本實驗中發現的產香酵母種類豐富，如畢赤酵母（Pichia）、光滑假絲酵母（Candida glabrata）、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）等，為白酒提供了復雜有層次的香味。異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）能夠產生豐富的香味物質，有吡嗪類物質、苯乙醇、愈創木酚等[24]。扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）能夠使醇類物質和酯類物質含量提高，如使乙酸乙酯、乙酸異戊酯及其他產物呈現清靈果香[25]。

從賒店老酒大曲中分離篩選的霉菌屬也在白酒的釀造過程中發揮著非常重要的作用。如根霉（Rhizopus）能產生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，能將淀粉近乎理論值地轉化為葡萄糖[26]，在釀酒過程中用做糖化菌，在發酵過程中也能產生乙酸乙酯、丙酸乙酯、正丙醇等芳香性成分，從而影響酒的品質。曲霉（Aspergillus）是大曲中產酶能力較強的一類微生物，自身能夠分泌葡萄糖氧化酶、糖化酶和蛋白酶，對于白酒的口感和質量起著至關重要的作用[27]。毛霉（Mucor）具有極其豐富的酶系，針對蛋白酶而言，就能產出酸性蛋白酶、堿性蛋白酶以及中性蛋白酶，可以合成端肽酶、分泌內肽酶，是一種天然的復合酶系[28]。另外，毛霉在生長過程中產生分解蛋白質的酶系能代謝積累乙酸和甘油等，對大曲的品質有一定的積極影響，這對曲酒的發酵進程具有非常重要的作用。

4 結論

本研究采用傳統培養分離法，研究了賒店老酒優質大曲中真菌的物種多樣性，通過傳統培養分離方法共得到45株酵母菌、103株霉菌，對其進行形態學觀察和分子生物學鑒定，結果表明，大曲中共鑒定出6株酵母菌和4個霉菌屬。6株酵母菌分別為：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）占71%、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）占2%、扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）占5%、發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）占9%、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）占2%、光滑假絲酵母（Candida glabrata）占11%。4個霉菌屬分別為：根霉屬（Rhizopus）占37%、橫梗霉屬（Lichtheimia）占33%、曲霉屬（Aspergillus）占18%、毛霉屬（Mucor）占12%。研究結果表明，賒店老酒優質大曲中含有豐富的真菌資源，為中原濃香型白酒的釀造微生物研究奠定了基礎。