果膠酶產生菌的篩選鑒定和酶學性質研究

楊逸飛，雷雨田，趙天恒，宋 琪，閆達中，彭 芳*

（1.武漢輕工大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430023；2.湖北省阿克瑞德檢驗檢測有限公司，湖北 武漢 430077）

果膠酶（pectinase）是指所有能催化分解果膠質的一類酶的總稱[1]，屬于一種復合酶。該復合酶包括原果膠酶（protopectinase）、聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠裂解酶（pectate lyase，PL）、果膠甲酯酶（pectinmethylesterase，PE）與纖維素酶（cellulase）等多種酶[2]。盡管自然界中天然果膠酶廣泛存在于動植物體內，但其產量低，難以大量提取，微生物由于生長周期短，培養條件簡單易控制，分布廣等優勢，是果膠酶的重要來源[3-4]。現代通常采用微生物發酵的方法，從微生物的代謝產物中提取果膠酶。一般來說果膠酶產生菌主要是真菌和細菌，在真菌中尤其以曲霉屬最為常見[5-7]。目前，果膠酶廣泛應用于食品工業的果汁加工和果汁澄清[8-9]以及造紙工業的紙漿脫膠、紡織和廢水處理等行業[10]。胡椒（Piper nigrumL.）是重要的熱帶香辛作物，被譽為“香料之王”，研究發現果膠是胡椒果皮中胞間層和初級細胞壁中起交聯作用的主要物質，胡椒脫皮可以采取水漚法、微生物酶法、微生物發酵法和冷凍機械脫皮法。水漚法脫皮耗時長（7～15 d），產品外觀差，有“異臭味”。利用微生物酶法、微生物發酵法等新方法替代傳統胡椒加工方法日益受到重視[11]。國內對胡椒生物酶法脫皮研究的重點主要聚焦于胡椒脫皮微生物的篩選、鑒定及脫皮效果的分析上[12-13]，微生物來源的果膠酶用于胡椒脫皮報道并不多，菌種單一，產酶成本高，沒有形成大規模生產。我國對果膠酶的研究、生產起步較晚，盡管果膠酶可以在中國生產，但品種單一，缺乏高效的果膠酶。面對果汁和食品加工行業的快速發展，許多果膠酶仍需要大量進口。因此，亟需篩選具有良好穩定性，高活性和高特異性的產果膠酶優良菌株，降低酶制劑成本。

本研究從海南胡椒種植園采集土壤，在這種環境中可能進化出可以降解胡椒果皮的微生物，采用剛果紅染色法從土壤中篩選能產生果膠酶的菌株，通過生理、生化實驗以及16S rRNA基因序列分析對高產果膠酶菌株進行鑒定，并對其所產果膠酶的酶學性質進行研究。以期為利用微生物酶法對胡椒脫皮的產業化打下基礎，也為果膠酶的生產提供優良的菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

采集海南胡椒種植園的土壤，去掉表層2～3 cm表層土。

1.1.2 化學試劑

果膠（半乳糖醛酸≥74.0%）：美國Sigma公司；剛果紅（指示劑級）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉（均為生化試劑）：英國OXOID公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS），溴甲酚紫、（NH4）2SO4、FeSO4、K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、FeCl3、NaCl（均為分析純）：國藥集團（上海）化學試劑有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）Mix、Taq酶：寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 培養基

液體初篩培養基：K2HPO42.0 g/L、MgSO40.5 g/L、果膠2.0 g/L、調整pH為7.2～7.4。115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。分別配制75 g/L（NH4）2SO4和0.5 g/L FeSO4水溶液，過濾除菌后再添加到初篩培養基中（每100mL培養基加入2mL母液），使（NH4）2SO4、FeSO4的終質量濃度分別為1.5 g/L 和0.01 g/L。

固體初篩培養基：在上述液體培養基中添加18.0 g/L的瓊脂粉。

發酵培養基：無機鹽成分與初篩培養基相同，將果膠的質量濃度調整為4.0 g/L。

LB平板：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH 7.4，瓊脂粉15 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

芽孢桿菌培養基：KCl 0.2 g，MgSO40.2 g，（NH4）2HPO41 g，酵母膏0.2 g，瓊脂粉7 g，糖或醇類10 g，蒸餾水1 000 mL，0.04%溴甲酚紫15 mL。調整pH為7.2，分裝到試管中使培養基高度約為4～5 cm，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

纖維素無機鹽培養基：CaCl20.1 g，K2HPO40.6 g，酵母膏0.05 g，MgSO40.5 g，KH2PO40.5 g，NaCl 1.0 g，NH4NO31.0 g，FeCl30.02 g，羧甲基纖維素8 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

淀粉培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉2 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min[5]。

明膠培養基：蛋白胨5 g，明膠100～150 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

半固體穿刺培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5 g，瓊脂粉3～6 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LAMBDATM25 Series 紫外可見光分光光度計：美國PerkinElmer公司；Biometra TProfessional Thermocycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：德國耶拿分析儀器股份有限公司；ZHJH-C1112B超凈工作臺、ZWYR-2102C搖床：上海智誠分析儀器有限公司；YXQ-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；SPX-300BSH-Ⅱ生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；5424R高速冷凍離心機：德國艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 高產果膠酶菌種的篩選

釋放土壤微生物：將土壤樣品取10 g于滅菌后的錐形瓶中加無菌水100 mL，放入28 ℃、200 r/min搖床72 h釋放土壤中的微生物，制成10%的土壤懸液備用。

初篩：將搖瓶中的上清液梯度稀釋為10-4、10-5、10-6后，各取100μL稀釋液分別涂布于初篩培養基平板上，放入28℃培養箱中培養約2～3 d，以長出菌落明顯為宜。選取長勢較好的菌落將其轉接至另外兩個初篩培養基平板上，放入28 ℃培養箱中培養。

復篩：待長出菌落明顯后，將一個平板倒入剛果紅溶液（5 mg/mL水溶液），使其完全覆蓋整個平板，靜置15 min。再倒去剛果紅溶液，用氯化鈉溶液（1 mol/L）重新覆蓋平板表面，靜置15 min，觀察菌落旁水解圈明顯且較大的菌株[14]。將另外相同平板上水解圈較大的菌株接種于液體初篩培養基中，放入28 ℃、200 r/min搖床培養48 h后，取0.5 mL培養液接種于50 mL的發酵培養基中，28 ℃、200 r/min搖床培養72 h后，吸取2 mL上清液，經4 ℃、12 000 r/min，30 min離心后作為粗酶液。將粗酶液適當稀釋后使用DNS定糖法測定果膠酶的活力，以此為依據篩選出活力相對較高的菌株[15]。

1.3.2 DNS定糖法檢測果膠酶活力

取培養液10 mL，12 000 r/min離心15 min，取上清液作為粗酶液。用pH值為6.5的K2HPO4-KH2PO4緩沖液10 mL溶解0.05 g的果膠。取1 mL加入EP管中，再加入粗酶液0.5 mL，攪拌器混勻，放入46 ℃水浴鍋中反應1 h。取0.13 mL反應后的混合液，加入另一EP管中，與0.47 mL的DNS試劑混合均勻。于100 ℃加熱10 min，用石英狹縫比色杯在波長540 nm處測定吸光度值，以滅活的酶液作為空白對照，每個樣品平行測定3次，結果取平均值。果膠酶酶活定義：在46 ℃、pH 6.5的條件下，1.0 mL果膠酶液每分鐘催化果膠生成1 μmol半乳糖醛酸的酶量定義為1個酶活單位（U/mL）。酶活計算公式如下[16-17]：

式中：A540nm樣品、A540nm對照分別為待測樣品酶和對照滅活的酶液在波長540 nm處的吸光度值；D為稀釋倍數；K為標準曲線斜率；t為反應時間，min。

1.3.3 菌株鑒定

（1）形態特征

將YY01菌液劃線于LB平板，28 ℃培養24 h，觀察菌落形狀、大小、顏色、水溶性色素等特征，并進行革蘭氏染色。

（2）生理生化試驗

糖、醇類發酵實驗，細菌運動性觀察實驗，淀粉水解實驗，纖維素水解實驗，明膠液化實驗參照文獻[18]，根據上述實驗結果，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[19]和《常見細菌系統鑒定手冊》[20]，結合16S rRNA測定的結果，鑒定分離的菌株種屬。

（3）分子生物學鑒定

將YY01菌液劃線于無機鹽平板，28 ℃培養24 h，煮沸法提取基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。采用細菌通用引物27F和1492R，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增16S rRNA。PCR擴增體系（20 μL）：ddH2O 12.8 μL，PCR Buffer（10×）2 μL，引物P1（27F）、P2（1492R）各1 μL，10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）Mix 2 μL，Taq酶0.2 μL，模板1 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。

擴增產物送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結果提交美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank（Accession Number：MF443454）數據庫，進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對分析，利用Mega X軟件對其他幾株類似菌屬的16S rRNA序列進行序列一致性和同源性分析。

1.3.4 果膠酶的酶學性質

（1）最適pH值、最適溫度測定

將果膠酶粗酶液加入到pH 7.0 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，分別測定30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃條件下酶活力。配制pH值分別為3.0～10.0的Na2HPO4-NaH2PO4和甘氨酸-NaOH緩沖液，將粗酶液加到上述各種不同pH值緩沖液中，測定45 ℃酶活力。

（2）pH穩定性、熱穩定性測定

將粗酶液分別加到pH值為3.0～10.0的緩沖體系中保持12 h后，重新使用緩沖液將pH調為最適反應pH下測定果膠酶的活力。以最適pH條件下未保溫的酶液測定的果膠酶活力記為100%，分別計算出不同pH條件下的相對酶活，考察酶的pH穩定性。酶的溫度穩定性測定：將稀釋后的酶液在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下處理6 h，取出1 mL然后立即將溫度調整至45 ℃放置于pH 7.0緩沖液中測定果膠酶活性，以不同溫度下未保溫酶液測定的果膠酶活力記為100%，分別計算出不同溫度條件下的相對酶活，考察酶的熱穩定性。

2 結果與分析

2.1 高產果膠酶菌株的篩選

2.1.1 初篩菌株水解圈大小測定結果

能分泌果膠酶的菌株，其菌落周圍的果膠被分解利用，利用剛果紅染色后菌落周圍出現透明圈的原理進行初篩，挑選出水解圈較大的菌株作為初篩菌株，結果見表1。由表1可知，篩選出3株菌落形態特征明顯不同的菌株，分別命名為1號、2號、3號，1號菌落米黃色偏白，圓形中間有小突起；2號菌落灰白色，邊緣不整齊，有毛刺；3號菌落灰白色，扁平圓形。其水解圈直徑和菌落直徑的比值分別為8、4、6。

表1 篩選菌株水解圈直徑大小比較Table 1 Comparison of hydrolytic circle diameter of screened strains

2.1.2 復篩菌株酶活力測定結果

將初篩得到的3株菌株平板劃線得到單菌落后，接種于液態發酵培養基發酵后測定其產生的粗酶液的酶活力。因為酶活力和測定的吸光度值呈正比例線性關系，故用吸光度值的大小來代表其粗酶液的酶活力的大小，結果表明，1號菌所產生的粗酶液的酶活力（97.5 U/mL）顯著高于其他兩個菌株（2號和3號分別為36.3 U/mL，51.8 U/mL）（P＜0.05），標記為YY01。經過3次連續傳代培養，菌株YY01在篩選平板形成均勻、水解圈較大且透明的單菌落如圖1所示，菌落質地均勻，較光滑、較粘稠、易挑起。在油鏡下觀察細胞形態，為桿狀、單個或線型排列，革蘭氏染色顯示為紫色，表明菌株YY01為革蘭氏陽性菌。因此，進一步對菌株YY01進行生理生化試驗分析及分子生物學鑒定。

圖1 菌株YY01的菌落形態及水解圈Fig.1 Colony morphology and hydrolytic circle of strain YY01

2.2 菌株YY01的鑒定

2.2.1 生理生化特性

將篩選菌株YY01單菌落到接種到相應的各種鑒定培養基，對其進行生理生化特性進行分析，結果見表2。由表2可知，菌株YY01的甘露醇、葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖發酵結果均為陽性；淀粉水解、纖維素分解、明膠液化結果均為陰性，不能運動。檢索《伯杰氏細菌鑒定手冊》，菌株YY01與芽孢桿菌的生理生化特征相吻合。初步斷定本研究篩選的果膠酶產生菌YY01屬于芽孢桿菌（Bacillus）。

表2 菌株YY01的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain YY01

2.2.2 菌株YY01的16S rRNA的測定結果

PCR擴增16S rRNA基因，PCR產物測序的結果拼接后，長度為1 438 bp，利用NCBI 的GenBank數據庫的BLAST程序進行序列一致性比對，利用Mega X構建16S rRNA基因系統進化樹見圖2。由圖2可知，菌株YY01的16S rRNA序列與PF4i 2的序列相似度達到了99.9%以上。因此，菌株YY01被鑒定為Bacillus niabensis。

圖2 基于菌株16S rRNA基因構建的菌株YY01的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain YY01 constructed based on 16S rRNA gene sequence

2.3 果膠酶的酶學性質

2.3.1 果膠酶最適pH值和最適溫度

由圖3A可知，果膠酶活力隨著pH升高而升高；當pH值為7.0時，果膠酶活力最高，達到98.8 U/mL。當pH值＞7.0以后，果膠酶活性呈現下降趨勢。因此，果膠酶最適pH值為7.0。由圖3B可知，隨著發酵溫度在30～45 ℃范圍內升高，果膠酶酶活力逐漸升高，當溫度為45 ℃時，果膠酶酶活最高，酶活力為97.5 U/mL；當溫度＞45 ℃之后，果膠酶活呈現下降的趨勢，到50 ℃時，果膠酶活急劇下降。因此，果膠酶最適溫度為45 ℃。

圖3 菌株YY01產果膠酶的最適pH（A）及最適溫度（B）Fig.3 Optimum pH (A) and temperature (B) of pectinase produced by strain YY01

pH對微生物營養物質的吸收和新陳代謝過程中酶的活性存在十分重要的作用，適宜的pH對菌種發酵起促進作用。溫度對酶用于食品加工也是非常重要的參數之一。JOSHI M等[21]從海洋沉積物中分離出來的枯草芽孢桿菌在堿性緩沖液中，在溫度為40 ℃時，果膠酶的活性最大。王齊瑋等[22]從大麻籽中篩選到7株產果膠酶的最高酶活為21.8 U/mL。本實驗篩選的菌株所產的果膠酶最適溫度為45 ℃時，酶活力為97.5 U/mL，具有較好的應用前景。

2.3.2 果膠酶的pH穩定性與溫度穩定性

由圖4A可知，不同pH保溫12 h后，果膠酶在pH 8.0時有75%的殘余酶活力，在pH 10時仍有52.5%的殘余酶活力。由圖4B可知，果膠酶在40 ℃時保溫6 h后有78.5%的殘余酶活力，在50 ℃時保溫6 h后仍具有64%的殘余酶活力。由此可見，該菌株產果膠酶具有一定耐堿性和耐高溫性。尹樂斌等[23]從果園土壤中篩選的一株高產果膠酶，發現在不同pH 4.0～7.0下，處理1 h，該酶還有50%的殘留酶活力；在30～50 ℃條件下，處理1 h，該酶還有80%的殘留酶活力。于平等[24]研究表明，從土壤中篩選的枯芽孢桿菌ZGL14，在50 ℃保溫100 min有86.7%的酶活力；在pH 10的條件下保溫100 min，仍有50.1%的酶活力。但在工業生產和果汁加工工藝研究中，果膠酶的酶解時間一般為2～5 h，酶解溫度為45 ℃[25-27]。以往的相關研究報道在時間上處理相對較短，與生產實際應用具有一定的差距。本實驗篩選的菌株YY01產生的果膠酶，在耐堿性和耐高溫性上，更符合果汁生產工藝的需要，具有開發用于果汁加工和胡椒脫皮的應用前景。

圖4 菌株YY01產果膠酶的pH（A）及溫度（B）穩定性Fig.4 Stability of pH (A) and temperature (B) of pectinase produced by strain YY01

3 結論

以果膠為唯一碳源，從海南寄送的泥土作為材料，通過稀釋平板涂布直接篩選和搖瓶傳代培養的方法篩選出一株產果膠酶菌株，經16S rRNA測序分析，結合生理生化實驗，革蘭氏染色等，將其鑒定為Bacillus niabensis。測定該菌株所產果膠酶的酶學性質，果膠酶的最適pH值為7.0，最適溫度為45 ℃；在pH 10.0時孵育12 h，仍有52.5%殘余酶活力；在50 ℃時孵育6 h，有64%殘余酶活力，表現出了較好的酸堿耐受性和熱穩定性，有應用到食品加工的潛力。