基于高通量測序技術分析不同地區自然陳化廣陳皮表面微生物群落多樣性

楊放晴，何麗英，楊 丹，申夢園，王 福，陳鴻平，劉友平*

（成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137）

廣陳皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulataBlanco）的栽培變種茶枝柑（Citrus reticulateChachi）的干燥成熟果皮[1]，有理氣健脾、燥濕化痰之功。在我國有著悠久的歷史，具有很高的藥用價值，同時作為傳統的香料和調味佳品，享有盛譽[2]。傳統理論認為陳皮“陳久者良”，即隨著陳化時間的增加，陳皮的質量會提高。目前，關于陳皮“陳久者良”的研究主要集中在不同陳化年限陳皮化學成分、藥理作用的強弱比較方面[3-4]，而對其科學內涵的現代研究相對薄弱。

本課題組前期報道陳皮表面的曲霉屬（Aspergillus）是引起黃酮類和揮發油含量與類型變化的重要因素[5]。陳聰聰[6]研究發現陳皮表面芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳酸鏈球菌屬（Lactococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等優勢細菌可加速其揮發油的生物轉化。這些研究證實了陳皮表面微生物會引起陳皮質量的變化。但未對陳皮陳化過程中微生物種群結構變化與氣候條件的關聯進行研究。文獻報道，不同地區特定的氣候環境影響微生物群落結構的變化[7-8]。課題組前期也通過對四川地區自然陳化1年川陳皮表面微生物與環境因子相關性研究，初步證實陳皮表面微生物群落變化與環境因子密切相關[9]。

高通量測序技術具有測序深度高、利于鑒定低豐度群落物種以及費用低的特點[10-11]。不僅能獲得樣品中微生物群落組成，還能將其相對含量進行數字化，已在白酒[12-13]、

醋[14]、腐乳[15]、發酵飲料[16]等的微生物多樣性分析得到廣泛應用，為環境樣品微生物群落結構多樣性分析提供了一種可靠有效的方法[17]。因此，本實驗采用高通量測序技術首次對溫帶季風性氣候（北京）、亞熱帶季風濕潤氣候（四川）、亞熱帶季風氣候（廣東）、亞熱帶高原季風氣候（云南）自然陳化1年廣陳皮表面細菌16S rDNA V4區、真菌內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）1區基因進行測序，并通過α和β多樣性分析對細菌、真菌群落結構組成進行分析，比較不同地區廣陳皮中微生物群落結構的差異，為探究適合陳皮陳化的氣候條件，同時為深入研究陳皮陳化機制，闡釋陳皮“陳久者良”科學內涵提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

為保證樣品的代表性和均一性，2020年1月初在廣東省江門市新會區三江鎮新馬單村采集當年產的橘皮，樣品均為蕓香科植物橘的栽培變種茶枝柑（Citrus Reticulate Chachi）的干燥成熟果皮。以麻布袋將樣品包裝后分別將其放置于北京市豐臺區西四環中路100號解放軍302醫院、四川省成都市溫江區柳臺大道1166號成都中醫藥大學、廣東省江門市蓬江區堤東路208號首層、云南省昆明市呈貢區雨花路1076號云南中醫藥大學的陰涼干燥通風的倉庫內，自然陳化1年后取樣，樣本編號分別為BJ、SC、GD、YN，每個樣本取5個生物學重復。

1.1.2 試劑

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD型潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；DZX-50KBS型立式高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；Bio-rad T100梯度PCR儀：美國Bio-Rad公司；NovaSeq 6000測序系統：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA提取和PCR擴增

參照文獻[18]提取廣陳皮樣品的總DNA，以其為模板，采用帶有Barcode序列的引物對515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）/806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和ITS1-1F-F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）/ITS1-1F-R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）分別對細菌16S rDNA V4區、真菌ITS1-1F區基因進行PCR擴增[19]。PCR擴增體系：Phusion Master Mix（2×）15 μL，正反向引物（2 μmol/L）各1.5 μL，gDNA（1 mg/L）10 μL，雙蒸水（ddH2O）2 μL。細菌PCR擴增條件：98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃再延伸5 min。真菌PCR擴增條件：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，35個循環；72 ℃再延伸7 min。利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，然后根據Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒說明書切膠回收PCR擴增產物。

1.3.2 文庫構建和上機測序

使用Illumina公司的TruSeqDNAPCR-FreeLibraryPreparation Kit進行文庫構建，構建好的文庫經Qubit定量和文庫檢測合格后，采用NovaSeq 6000上機測序。

1.3.3 高通量測序數據處理與分析

去除Barcode序列和引物序列，使用FLASH（V1.2.7）軟件進行拼接，得到原始序列數據。原始序列數據進行嚴格的過濾處理[20]后參照QIIME（V1.9.1）[21]的序列質量控制流程，與物種注釋數據庫比對剔除嵌合體，得到有效序列。以97%的一致性進行操作分類單元（operationaltaxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTUs的代表序列。根據OTUs聚類結果，細菌用Mothur方法與SSU rRNA數據庫[22]對OTUs代表序列進行物種注釋分析（設定閾值為0.8～1.0）；真菌通過QIIME軟件中的BLAST方法與Unit數據庫進行物種注釋分析，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時，使用QIIME軟件計算Alpha多樣性（Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Coverage指數），采用R軟件（V2.15.3）分別進行Alpha多樣性指數組間差異分析、Venn圖與非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）圖繪制，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。

大約10%的肺膿腫患者需要行手術切除。手術指征分為急性和慢性。急性期手術指征為：咯血，持續的敗血癥發熱，膿腫破潰到胸膜腔形成膿氣胸或膿胸。慢性期手術指征為：抗生素治療超過6周無效，懷疑肺癌或膿腔超過6cm。膿腫較大或者位置較深的需要做肺葉切除術。如果切除范圍能夠包含膿腔以及周圍的壞死組織，非解剖型肺切除或肺段切除也是合適的手術選擇[6]。

2 結果與分析

2.1 測序數據統計分析

不同地區自然陳化1年的廣陳皮中細菌、真菌的有效序列及OTUs數分別見表1和表2。由表1可知，不同地區廣陳皮樣品中，細菌共獲得1 279 520條有效序列，平均堿基長度為252～253 bp，共得到可分類的OTUs數目約40 267個。由表2可知，真菌共獲得1 284 394條有效序列，平均堿基長度為226～233 bp。共得到可分類的OTUs數目約6 163個。

表1 不同地區廣陳皮中細菌的有效序列及OTUs數目Table 1 Effective sequences and OUTs numbers of bacteria in Chachi samples from different regions

表2 不同地區廣陳皮中真菌的有效序列及OTU數目Table 2 Effective sequences and OUT numbers of fungi in Chachi samples from different regions

2.2 α-多樣性分析

Coverage指數代表測序對物種的覆蓋度；Shannon指數和Simpson指數用于衡量微生物群落的多樣性，Chao1指數和ACE指數用于估算樣品中微生物的豐富度[23]。不同地區自然陳化1年廣陳皮表面細菌及真菌的α-多樣性分析結果分別見表3和表4。

表3 不同地區廣陳皮中細菌群落α-多樣性分析結果Table 3 Analysis results of α-diversity of bacteria community of Chachi samples from different regions

表4 不同地區廣陳皮中真菌群落α-多樣性分析結果Table 4 Analysis results of α-diversity of fungi community of Chachi samples from different regions

由表3和表4可知，所有樣本的Coverage指數均達到0.99，表明測序結果能完整反映陳皮表面微生物群落組成信息。就細菌而言，不同地區自然陳化1年廣陳皮樣品Shannon指數、Simpson指數無顯著差異（P＞0.05）；云南地區樣品的Chao1指數及ACE指數高于其他地區樣品，分別為2 088.45、2 157，但不存在顯著差異性（P＞0.05）；就真菌而言，不同地區自然陳化1年廣陳皮樣品Shannon指數、Simpson指數無顯著差異（P＞0.05）；廣東地區樣品的Chao1指數及ACE指數高于其他地區樣品，分別為326.59、338.77，但不存在顯著差異性（P＞0.05）。說明在不同地區自然陳化1年的廣陳皮表面微生物的多樣性及豐富度無顯著性差異，這可能與陳化時間較短有關。

2.3 微生物群落組成分析

基于門水平，不同地區廣陳皮樣品中細菌及真菌群落結構見圖1。

圖1 基于門水平不同地區廣陳皮樣品中細菌（a）及真菌（b）群落結構Fig.1 Community structure of bacteria (a) and fungi (b) in Chachi samples from different regions based on phylum level

由圖1a可知，在門水平上，不同地區自然陳化1年的所有樣本中細菌主要包括變形菌門（Proteobacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、Acidobacteriota等。不同地區自然陳化1年廣陳皮樣品中細菌群落結構組成基本相同，但相對豐度差異較大。其中Proteobacteria、Cyanobacteria在4個地區廣陳皮樣品中相對豐度較高，Proteobacteria在北京、四川、廣東和云南地區的廣陳皮樣品中的相對豐度分別為47.62%、49.48%、48.69%、41.94%，Cyanobacteria的相對豐度分別為37.99%、31.44%、36.44%和43.45%。

由圖1b可知，子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）在不同地區自然陳化1年廣陳皮表面真菌中占主導地位。不同地區自然陳化1年廣陳皮樣品中真菌群落結構組成基本相同，但相對豐度差異較大。Ascomycota在云南地區廣陳皮樣品中相對豐度最高，為83.23%，在四川地區相對豐度最低，為54%。Basidiomycota在北京、四川、廣東和云南地區廣陳皮樣品中的相對豐度分別為18.83%、37.34%、22.86%和14.12%。此外，羅茲菌門（Rozellomycota）僅在四川地區存在，相對豐度為0.96%。

基于屬水平，不同地區自然陳化1年廣陳皮樣品中細菌及真菌群落結構見圖2。

圖2 基于屬水平不同地區廣陳皮樣品中細菌（a）及真菌（b）群落結構Fig.2 Community structure of bacteria (a) and fungi (b) in Chachi samples from different regions based on genus level

由圖2a可知，在屬水平上，不同地區自然陳化1年廣陳皮樣本中細菌主要包括unidentifiedChloroplast、unidentifiedMitochondria、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等。其中unidentifiedChloroplast和unidentifiedMitochondria在4個地區廣陳皮樣品中相對豐度較高，在云南地區兩者豐度之和最大，為62.27%，廣東地區兩者豐度之和最小，為42.18%。說明不同地區廣陳皮中細菌多樣性有待進一步挖掘和發現。Methylobacterium在四川地區廣陳皮樣品中相對豐度最大，為15.59%，在廣東地區廣陳皮樣品中相對豐度最小，為4.99%，在北京和云南地區廣陳皮樣品中相對豐度分別8.97%和6.81%。Sphingomonas、Mesorhizobium、Bacillus在四川地區廣陳皮樣品中相對豐度最高，分別為2.86%、2.04%和1.22%。值得注意的是，研究報道Bacillus、Lactococcus可加速陳皮中揮發油的生物轉化[6]。

由圖2b可知，不同地區自然陳化1年廣陳皮樣本中真菌屬主要包括平臍疣孢屬（Zasmidium）、枝孢霉屬（Cladospo rium）、短梗霉屬（Aureobasidium）、酵母菌屬（Symmetrospora）、unidentifiedCystobasidiomycetessp.、鑲刀菌屬（Fusarium）、紅酵母屬（Rhodotorula）、擔孢酵母屬（Erythrobasidium）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、赤霉菌屬（Gibberella）、擬棘殼孢屬（Pyrenochaetopsis）和曲霉屬（Aspergillus）等。其中Zasmidium在云南地區相對豐度最大，為45.77%；Cladosporium、Aureobasidium和Colletotrichum在北京地區相對豐度最大，分別為16.80%、27.27%、4.18%；Symmetrospora、Aspergillus在四川地區相對豐度最大，分別為13.00%、1.16%。unidentifiedCystobasidiomycetessp.在廣東地區相對豐度最大，為7.99%。Rhodotorula僅在北京、四川地區中存在，且在四川地區相對豐度最大，為8.77%。外瓶霉屬（Exophiala）僅在四川地區存在，其相對豐度為1.32%。值得注意的是，課題組前期報道陳皮表面黑曲霉（Aspergillus niger）是引起黃酮類和揮發油含量與類型變化的重要因素[5]。但不同地區自然陳化1年廣陳皮樣品表面Aspergillus檢出較少，這可能與陳皮陳化時間較短相關。

2.4 不同地區廣陳皮樣品微生物群落比較

為了說明不同地區自然陳化1年廣陳皮樣本物種組成的相似性情況[24]，對不同地區廣陳皮中細菌及真菌的OTU進行Venn圖繪制，結果見圖3。

圖3 基于OTU水平不同地區廣陳皮中細菌（a）及真菌（b）Venn圖Fig.3 Venn diagrams of bacteria (a) and fungi (b) of Chachi samples from different regions based on OTU level

由圖3可知，在OTUs組成上，四川、北京、云南、廣東地區自然陳化1年的廣陳皮表面細菌群落分別得到585、748、794和697個特有OTU，共有OTU數為1 826個；真菌群落分別得到282、154、71和159個特有OTU，共有的OUT數為272個，且不同地區自然陳化1年廣陳皮表面，真菌種類明顯少于細菌種類。

非度量多維標度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）法是一種將多維空間的研究對象（樣本）簡化到低維空間進行定位、分析和歸類，同時又保留對象間原始關系的數據分析方法[25]。對不同樣本間的差異程度，通過點與點間的距離進行體現，距離越近，則樣本組成越相似。基于屬水平，不同地區廣陳皮中細菌及真菌的NMDS分析結果見圖4。

圖4 基于屬水平不同地區廣陳皮中細菌（a）及真菌（b）的NMDS結果Fig.4 NMDS results of bacteria (a) and fungi (b) of Chachi samples from different regions based on genus level

由圖4可知，不同地區所有廣陳皮樣品距離較近，說明不同地區自然陳化1年廣陳皮樣品中細菌及真菌群落組成相似。

為進一步比較不同地區自然陳化1年廣陳皮樣品在屬水平上群落組成的相似性和差異性，根據所有樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取相對豐度排名前35的屬進行相似性聚類，得到聚類分析熱圖，結果見圖5。一個樣品在某個分類上的Z值為樣品在該分類上的相對豐度和所有樣品在該分類的平均相對豐度的差與所有樣品在該分類上的標準差的比值，將聚類分析熱圖中Z＞1的物種定義為優勢菌屬。

圖5 基于屬水平細菌（a）及真菌（b）群落物種相對豐度聚類熱圖Fig.5 Cluster heatmap of relative abundance of bacteria (a) and fungi (b) community species based on genus level

由圖5a可知，北京地區自然陳化1年廣陳皮表面優勢細菌屬為Methylocella、苔蘚桿菌屬（Bryobacter）和短小桿菌屬（Curtobacterium）；四川地區自然陳化1年廣陳皮表面優勢細菌屬為Methylobacterium、Sphingomonas、Bacillus、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、副球菌屬（Paracoccus）、膨脹芽胞桿菌屬（Tumebacillus）、溶菌桿菌（Lysinibacillus）、Tundrisphaera、乳球菌屬（Lactococcus）、嗜酸菌屬（Acidiphilium）；廣東地區自然陳化1年廣陳皮表面優勢細菌屬為Rubellimicrobium、乳桿菌屬（Lactobacillus）、放線孢菌屬（Actinomycetospora）；云南地區自然陳化1年廣陳皮表面優勢細菌屬為unidentifiedChloroplast、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）、Glutamicibacter、馬賽菌屬（Massilia）、羅河桿菌屬（Rhodanobacter）。

由圖5b可知，北京地區自然陳化1年廣陳皮表面優勢真菌屬為Aureobasidium、Colletotrichum、Pyrenochaetopsis、Roussoella、Sarcopodium、Wallemia、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）；四川地區自然陳化1年廣陳皮表面優勢真菌屬為Symmetrospora、Rhodotorula、Gibberella、unidentifiedPucciniomycetessp.、紅冬孢酵母屬（Rhodosporidiobolus）、Aspergillus、Exophiala、Pseudoramichloridium、Naganishia；廣東地區自然陳化1年廣陳皮表面優勢真菌屬為unidentifiedCystobasidiomycetessp.、Pseudocercospora、毛殼菌屬（Chaetomium）、耐干霉菌屬（Xeromyces）、Cystobasidium、漢納酵母屬（Hannaella）、Ectophoma、隱球酵母屬（Cryptococcus）、鏈格孢屬（Alternaria）、彎孢屬（Curvularia）；云南地區自然陳化1年廣陳皮表面優勢真菌屬為Zasmidium、擬暗球腔菌屬（Phaeosphaeriopsis）、小粉孢屬（Microidium）和多臂菌屬（Trichomerium）。文獻報道，陳皮表面Methylobacterium、Sphingomonas、Lactococcus、Bacillus等細菌可加速揮發油的生物轉化[6，26]，Aspergillus是引起黃酮類和揮發油含量與類型變化的重要因素。Methylobacterium、Sphingomonas、Lactococcus、Bacillus、Aspergillus為四川地區的優勢菌屬，說明四川地區的氣候條件比較適合廣陳皮的自然陳化。

3 結論

本研究通過高通量測序技術分析了不同地區自然陳化1年廣陳皮樣品表面微生物群落多樣性變化及優勢菌群分布。分析結果表明，不同地區自然陳化1年廣陳皮樣品豐富度和多樣性不存在顯著差異（P＞0.05），微生物群落結構相似，但相對豐度存在差異，優勢菌屬不同。Methylocella、Bryobacter和Curtobacterium為北京地區優勢細菌，Methylobacterium、Sphingomonas、Bacillus等為四川地區優勢細菌，Rubellimicrobium、Lactobacillus、Actinomycetospora為廣東地區優勢細菌，unidentifiedChloroplast、Ralstonia、Glutamicibacter、Massilia、Rhodanobacter為云南地區優勢細菌。Aureobasidium、Colletotrichum、Pyrenochaetopsis等為北京地區優勢真菌，Symmetrospora、Rhodotorula、Gibberella等為四川地區優勢真菌，Pseudocercospora、Chaetomium、Xeromyces等為廣東地區優勢真菌，Zasmidium、Phaeosphaeriopsis、Microidium和Trichomerium為云南地區優勢真菌。四川地區優勢細菌屬Methylobacterium、Sphingomonas、Lactococcus、Bacillus可加速揮發油的生物轉化，優勢真菌屬Aspergillus是引起黃酮類和揮發油含量與類型變化重要因素。說明四川地區的氣候條件比較適合廣陳皮的自然陳化。