鮮菌草工廠化栽培銀耳物質轉化特性研究

林興生， 王澤輝， 馬運龍， 林占熺， 林 輝， 林冬梅， 羅海凌

(福建農林大學國家菌草工程技術研究中心， 福州 350002)

1 引 言

銀耳(TremellafuciformisBerk.) ，又稱雪耳、白木耳，有“菌中之冠”之稱，隸屬于銀耳科(Tremellaceae)，銀耳屬(Tremella)[1]，在我國有悠久的食用歷史，現代醫學研究證明銀耳子實體種中含有多糖、黃酮及氨基酸等多種成分，其中銀耳多糖為其重要的活性物質[2].常規人工栽培銀耳的方式主要有段木栽培和代料栽培兩種[3].1983年福建農林大學林占熺研究員嘗試以五節芒、類蘆、蘆葦等草本植物為主要原料栽培銀耳等食藥用菌，發明了菌草技術，菌草定義為適宜栽培食藥用菌的草本植物，菌草是一類新的草種類別，是新型生物材料.1989年在福建省尤溪縣用五節芒等野生菌草栽培銀耳示范生產獲得成功[4].2009年開展鮮菌草栽培銀耳的研究[5]，取得重要進展，表明鮮菌草栽培銀耳可行，利用鮮菌草栽培銀耳利于可持續發展.綠洲1號(Arundodonaxcv. Lvzhou No.1)隸屬于蘆竹屬，種名未定，是近年來培育推廣的主要菌草之一.

氣相色譜-質譜聯用法(Gas Chromatography Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry, GC-MS)具有分離效果好、靈敏度高及易于定性定量分析等優點，代謝組學是反應生物生理狀態的重要工具[6-7]，已在食用菌研究中廣泛應用[8]，張燕揭示了平菇多糖調節肝損傷病大鼠的液檸檬酸、蘋果酸和D-葡萄糖醛酸等代謝通路，從而改善肝損傷大鼠癥狀，具明顯的保肝作用[9].李佳琪揭示刺芹側耳栽培料中木質素的代謝產物關系到軟木質單體合成、香豆素合成、丁香油酚合成等代謝途徑[10].李翔從椴木銀耳、袋栽銀耳中檢測出86種揮發性成分，證明椴木銀耳中相對含量最高的是乙酸，袋栽銀耳中相對含量最高的是正乙醛[11].銀耳子實體生長，需要香灰菌把培養料中大分子物質分解成小分子物質[12].培養料中只有在原基處既可檢測到銀耳菌絲，又能檢測到香灰菌[13]，因此原基處是銀耳生長過程中營養轉化的重要部位.目前關于銀耳栽培中物質轉化特性鮮有報道，本文旨在通過GC-MS法研究鮮菌草工廠化栽培銀耳不同生長期原基處的物質轉化特性，為鮮菌草工廠化栽培銀耳提供理論依據.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 供試菌株 銀耳XY-04(A4)菌株，由福建省祥云生物科技發展有限公司提供.

2.1.2 供試配方 鮮菌草替代部分棉籽殼工廠化栽培銀耳的培養基配方：鮮綠洲1號菌草55.5%、棉籽殼15.5%、麥麩28%、石膏1%、含水量58%，鮮綠洲1號菌草采自福建農林大學尤溪洋中科教基地，于配料前一天收割粉碎備用.

2.1.3 供試樣品 在福建省祥云生物科技發展有限公司栽培車間內工廠化栽培銀耳，分別在菌絲生長期G1(接種后12 d)、原基分化期G2(接種后24 d )和子實體生長期G3(接種后36 d )三個生長期的培養基表面原基分化處取培養料采樣，迅速凍存樣品，每組樣品3個重復.

圖1 G1、G2和G3三個不同生長期長勢圖Fig.1 Growth situation of Tremella fuciformis in three stages of G1, G2 and G3

2.1.4 主要儀器和試劑 Agilent氣相色譜-7890A，LEVO質譜儀-PEGASUS HT，Agilent色譜柱-DB，Thermo Fisher Scientific 離心機-Heraeus Fresco17，Thermo Fisher Scientific超低溫冰箱-Forma 900 series，Sartorius分析天平-BSA124S-CW，Merck Millipore純水儀-明澈 D24 UV.甲醇(Methanol)，氯仿(Chloroform)，吡啶(Pyridine)，甲氧銨鹽(Methoxyaminatio hydrochloride)，L-2-氯苯丙氨酸(2-Chloro-L-phenylalanine)：BSTFA(with 1% TMCS，v/v)；飽和脂肪酸甲酯(FAMEs).

2.2 方 法

2.2.1 樣本提取 將樣品混合均勻后取100 mg 于2 mL EP 管中，向管中先加入1 000 μL 預冷提取液(V甲醇∶V水=3∶1)，混合均勻后加入10 μL 的內標溶液(L-2-氯苯丙氨酸)，蓋緊瓶蓋放在渦旋混勻器上渦旋30 s；向EP管中加入瓷珠，使用研磨儀在35 Hz條件下處理 4 min，超聲5 min，重復3次，全程在冰水浴中進行；將處理還得樣本進行4 ℃離心，離心條件為10 000 r/rpm 、15 min；取200 μL上清液于轉入新的1.5 mL EP 管中；將裝有上清液的EP管放入真空濃縮器中干燥提取物：從真空濃縮機中取出已經干燥好的提取物，向干燥后的代謝物加入60 μL甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶 20 mg/mL)，輕輕混勻后，放入烘箱中 80 ℃孵育 30 min；孵育完成后，向每個樣品中加入80 μL BSTFA(含有1% TMCS，v/v)，混合后放入烘箱中70 ℃孵育1.5 h；孵育結束后將樣品上機檢測.

2.2.2 GC-MS檢測 使用Agilent7890氣相色譜儀和飛行時間質譜儀對樣品進行GC-TOF-MS分析.系統采用DB-5MS毛細管柱.1 μL樣品均以無分裂方式注入.以氦為載氣，前入口吹掃流量3 mL/min，通過柱的氣體流量1 mL/min.初始溫度保持在50 ℃下1min，然后以10 ℃/min的速率提高到310 ℃/ min，然后在310 ℃下保持8 min. 進樣口、傳輸線和離子源溫度分別為280 ℃、280 ℃和250 ℃.在電子沖擊模式下，能量為-70 eV.質譜數據在全掃描模式下獲得，m/z范圍為50～500，溶劑延遲6.30 min后，每s12.5光譜的速率.

2.2.3 數據處理與分析 使用Chroma TOF軟件對質譜數據進行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析[14]，用 LECO-Fiehn Rtx5數據庫對代謝物質進行定性，包括質譜匹配和保留時間指數匹配[15].對處理后的數據進行主成分分析(Principal component analysis, PCA)、偏最小二乘法判別分析(Partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)及正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal PLS-DA，OPLS-DA)，找出差異代謝物，通過匹配KEGG Pathway、HMDB和PubChem等數據庫得到差異表達代謝物的代謝通路信息.

3 結果與分析

3.1 總離子流色譜圖

如總離子流色譜圖所示，鮮菌草工廠化栽培銀耳三個不同生長期培養基中共檢測到1004個峰，對質譜數據進行預處理后獲得737個代謝特征峰，表明鮮菌草工廠化栽培銀耳三個不同生長期的代謝物明顯不同(圖2).

圖2 三個生長期樣品GC-TOF-MS 總離子流圖Fig.2 GC-TOF-MS total ion current from 3 stages of samples

3.2 主成分分析(PCA)

不同生長期的原基處的代謝組主成分分析結果如圖3，反映了組內和組間的變異度，提高篩選差異代謝物的可靠性.圖中每個點代表一個樣品，不同顏色代表不同組別，兩種顏色符號的離散程度代表了兩組樣本在PC1和PC2軸上的分布趨勢，兩種顏色符號的離散程度越大，表明對應樣品的代謝差異越明顯.不同生長期的樣品分別落在自己的置信區間，位于圖中的左右兩側，表明不同生長期樣品的代謝差異較大，組內樣品差異較小，表明同一生長期重復性好.

圖3 三個不同生長期樣品的PCA得分圖

3.3 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)

為更大程度反應組別之間的差異和挖掘代謝信息，采用偏最小二乘法判別分析法(Partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)對數據進行分析，計算變量重要投影度(Variable Importance in the Projection, VIP)，通過VIP值的大小來衡量不同的代謝物對不同樣品影響大小和解釋能力.結果如圖4所示，橫坐標代表第一主成分得分，縱坐標代表正交主成分得分，從PLS-DA得分表明，不同組別之間都得到了很好的區分，驗證了不同生長期存在著顯著差異，樣本全部都處95%置信區間內，可信度高.

圖4 三個不同生長期樣品的PLS-DA得分圖

3.4 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

OPLS-DA比PLS-DA多一步正交換算，把模型分類不相關的信息過濾掉，以便最大化凸顯模型組別之間的差異， OPLS-DA的解釋能力更強.如圖5所示，橫坐標代表主要成分的得分值(Tp)主要反應組間的差異，縱坐標代表主要成分的正交得分值(TO)主要反映組內樣品間的差異.結果顯示組內間差異較小，組間即不同生長期差異明顯.

圖5 三個不同生長期樣品的OPLS-DA得分圖

3.5 代謝物質相對含量計算以及差異代謝物篩選

3.5.1 內標參照與質量控制 樣本中檢測到物質的相對含量值以內標物質的質譜峰面積作為參照計算而來，內標物質為L-2-氯苯丙氨酸溶液.如表1，一方面通過內標物質的響應情況判定檢測儀器的穩定狀況，在質譜上機過程中，共檢測10例樣本，其中第1例和第10例為重復樣本，以重復樣本中內標的穩定性判斷檢測過程中是否有系統偏差，內標在重復樣品中峰面積相對標準偏差(RSD)≤10%，說明儀器數據采集穩定，本次檢測結果為RSD值為1.07%，說明系統十分穩定；另一方面以內標物質作為后續樣本中物質的相對定量參照，以內標物質的質譜峰面積作為參照，對質譜檢測得到的下機數據質譜峰進行過濾，保留缺失值在實際樣本中< 80%的峰值；對保留下來數據的缺失值進行最小值二分之一填補；然后利用每個樣本的總離子流及內標物質的峰面積值進行數據歸一化處理，得到各個檢測物質的相對含量值.

表1 內標參照及響應

3.5.2 代謝物貢獻值評價和差異代謝物篩選 采用PLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(VIP)的大小來評價代謝物對模型的貢獻值，VIP>1表明數據對模型的貢獻值高，差異性大，結合t檢驗中的P值，P<0.05說明對模型的貢獻值大.G2與G1共有426種代謝物差異，其中263種物質呈現代謝下調，163種物質呈現代謝上調，另有163種物質沒有明顯變化.G3與G2共有423種差異代謝物，其中185種物質呈現代謝下調，238種物質呈現代謝上調，另有256種物質沒有明顯變化.G3與G1 共466種差異代謝物，其中242種物質呈現代謝下調，204種物質呈現代謝上調，另有207種物質沒有明顯差異.根據FC的大小篩選得到三個不同生長期的代表性物質，如表2～4所示.

表2 G2與G1差異代謝物分析

表3 G3與G1差異代謝物分析

表4 G3 與 G2差異代謝物分析

3.6 代謝通路分析

為了進一步解釋差異代謝物在銀耳生長過程中可能的生物學功能，對已經篩選得到的差異代謝物進行代謝通路分析.顯著差異代謝物的路徑分析氣泡圖如圖6所示，結果表明，三個不同生長期代謝差異主要集中在脂肪酸合成，乙醛酸和二羧酸代謝及檸檬酸循環(TCA循環)這三個代謝途徑，在銀耳生長的三個不同生長期存在明顯的差異，除去這三個途徑外，G2與G1在不飽和脂肪酸合成途徑存在明顯差異，這可能與銀耳菌絲二種形態的轉變有密切的關系；G3與G2在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑存在差異，這可能與后期自身生長需要大量蛋白質和酶有密切關系；G3與G1甘油酯代謝存在明顯差異.

圖6 顯著差異代謝物的路徑富集分析氣泡圖Fig.6 Bubble map of path enrichment analysis of Significant differences in metabolites

4 討 論

在鮮菌草工廠栽培銀耳過程中，菌絲生長期G1(接種后12 d)、原基分化期G2(接種后24 d )和子實體生長期G3(接種后36 d )是銀耳栽培和生長發育的具有代表性的階段，代表從營養生長到生殖生長的全過程，三個不同生長期的原基處代謝物質存在明顯的差異，通過對三個生長期兩兩對比篩選，G2比G1觀察到426個顯著差異代謝物特征峰；G3比G2共發現423個顯著差異代謝物特征峰； G3比G1共有466個顯著差異代謝物特征峰.其中G2期與G1期的糖類(蔗糖、麥芽糖和海藻糖等)相對于G3期代謝上調，表明銀耳在前期原基形成和子實體生長中需要大量的糖類物質供給，這也可能與銀耳菌絲可利用單糖和雙糖等簡單的糖類作為主要的碳源，不能直接利用多糖和淀粉等大分子物質有關[1].G3期與G 1期在脂肪類、萜類等揮發性物質含量增加，表現出代謝上調，間接表明銀耳子實體內的萜類、芳香類物質的合成主要集中在子實體生長后期.

對差異代謝物進一步篩選和進行代謝通路進行匹配，發現三個不同生長期的差異途徑主要集中在脂肪酸合成，乙醛酸和二羧酸代謝及檸檬酸循環(TCA循環)，其中脂肪酸代謝對維持細胞膜的完整結構[16]、為菌絲生長提供能量[17]和調節脂質代謝[18]有重要的作用；乙醛酸和二羧酸代謝是糖類物質和脂類物質的轉化有重要的作用；檸檬酸循環在代謝中有核心的作用，糖類，氨基酸和脂肪都是檸檬酸循環的中間體[19-20]，并且可為呼吸鏈提供還原當量[21]，說明這三個代謝途徑在原基處為原基的形成和子實體生長提供重要的代謝物質.除這三個途徑外G2與G1在不飽和脂肪酸合成途徑存在明顯差異，這可能與銀耳原基形成需有著密切的關系；G3與G2在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑存在差異，氨基酸類物質代謝的增加，伴隨著氨基酸多肽的大量形成，以便合成蛋白質和酶提供給銀耳子實體的生長；G3與G1甘油酯代謝存在明顯差異，這與后期子實體生長需要大量的膠狀物質有密切的關系.