外源性激素對光棘球海膽性別相關基因dmrt1、foxl2和boule 表達的影響

胡彪，崔洲平，魏金亮，張健，王婭，張偉杰，孫志惠，常亞青

（大連海洋大學農業農村部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧 大連 116023）

光棘球海膽Mseocentrotus nudus（又稱大連紫海膽）唯一可食用的性腺味道鮮美、營養豐富、市場價值高，是我國重要的海產經濟海膽之一[1]。

類固醇激素（Steroid hormone）（甾體激素）在維持生命、調節性功能以及繁殖調控等方面行使重要功能，其中性激素，尤其是雌二醇和睪酮在動物的性別分化及性腺發育中發揮重要作用。用外源17β-雌二醇處理，可促進小鼠卵母細胞的體外成熟[2]，用外源性17α-甲基睪酮處理能夠促進生長前期的卵泡發育，后期則呈抑制作用[3]；用外源17α-甲基睪酮處理會導致斑馬魚Danio rerio 雌魚發生性逆轉，其性腺表型由卵巢轉變為精巢[4]。用外源性17β-雌二醇處理會導致斑馬魚種群的雌性比例上升，雄魚第二性征減弱，部分雄魚發育出卵巢樣的性腺[5]；同樣，外源性17β-雌二醇也能促進青鳉Oryzias latipes 朝雌性發育[6]。在外源性17α-甲基睪酮處理下正常雌性虹鱒Oncorhynchus mykiss可被誘導為性腺組織與卵巢類似的偽雄性[7]。無脊椎動物中，是否存在與脊椎動物類似的性激素尚有爭議[8-10]。用外源雌二醇浸泡處理可促進貽貝Elliptio complanata 卵黃蛋白原基因表達[11]。紅海盤車Asterias rubens 性腺中檢測到雌二醇和孕酮，且其激素水平與卵巢發育息息相關[12]；在同屬海膽綱的巨紫球海膽Strongylocentrotus franciscanus 中，Botticelli 等[13]利用蒸餾、層析等方法，證實巨紫球海膽性腺中存在雌激素，且17-β 雌二醇活性最強。然而，作為我國市場價值較高的光棘球海膽性腺中是否存在性激素尚不明確；性激素在該海膽性腺發育中的作用也有待探究。

性腺的發育需要眾多性別相關基因相互作用、共同調控。其中dmrt1 基因是目前已知最為保守的、與雄性性別決定和精巢發育相關的關鍵基因[14]。foxl2 基因則是進化上高度保守，與卵巢分化和維持相關的基因[15,16]。boule 基因隸屬于DAZ 基因家族，是多個物種生殖細胞的標記基因[17,18]。研究表明，用外源性雌二醇與睪酮處理對不同物種的dmrt1 和foxl2 基因表達的影響不同，如雌二醇處理會降低中華鱉Pelodiscus sinensis 成體dmrt1 基因表達[19,20]，而使成體與早期胚胎的foxl2 基因表達上調；用外源雌二醇處理會導致斑馬魚dmrt1 基因表達量顯著上升[21]，導致大黃魚Larimichthys crocea foxl2 基因表達下調[22]。用外源睪酮處理后，半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis 會發生性逆轉，其性別表型由雌性逆轉為雄性，由卵巢轉化成的精巢中可以檢測到dmrt1 基因的表達[23]；外源睪酮處理后，中華鱉雌雄個體中foxl2 基因表達上升[20]。而針對外源性激素對boule 基因表達影響的研究較少，雌二醇與睪酮對boule 基因表達的影響尚不明確。

在前期研究中，克隆獲得了光棘球海膽dmrt1、foxl2 和boule 基因，發現dmrt1 基因在光棘球海膽性腺中呈現雄性特異性表達，foxl2 和boule 基因在光棘球海膽性腺中均呈現差異性表達，在精巢中表達量分別為卵巢中的6 倍和25 倍。本研究通過檢測光棘球海膽性腺中雌二醇、睪酮和孕酮的含量，通過向海膽體內注射17β-雌二醇或17α-甲基睪酮，分析海膽性腺中dmrt1、foxl2 和boule 基因的表達變化，可為進一步研究激素對光棘球海膽性腺發育的影響提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用光棘球海膽由大連海洋大學農業農村部北方海水增養殖重點實驗室自行繁育。隨機選取60 只，初始直徑（3.47±2.27）cm，初始質量（25.04±1.75）g，養殖于循環水槽中，每天半量換水，每3 d 換水1 次，投喂海帶及常見藻類。

試驗藥品為17β-雌二醇（sigma，E8875-250）和甲基睪酮（sigma，M7252-1）溶解于1 mL 無水乙醇，制成10 mg/mL 的母液，然后用葵花籽油稀釋成1 mg/mL 的應用液。

1.2 方法

取6 只海膽解剖收集體腔液，于4℃1 000 r/min 離心20 min，分離體腔液上清，保存于超低溫冰箱（-80℃），用于檢測激素含量。收集海膽的部分性腺組織于無酶離心管中，用液氮速凍后保存于超低溫冰箱（-80℃）中，用于檢測激素含量。剩余的性腺組織于4%Perfluoroalkoxy（PFA）中，4℃固定過夜；第2 d 用PBS 搖洗三次，每次5 min，完成后用30%蔗糖于4℃滲透過夜；第3 d 用組織包埋劑OCT（Tissue-Tek，上海）包埋，保存于超低溫冰箱（-80℃）中用于制作冰凍切片樣品。

將60 只海膽隨機分為三組,飼養在用網分隔成三個區域的室內1 000 L 水槽中：每天用25 μL 微量注射器由圍口膜處注射10 μL 雌二醇應用液（雌二醇組）、睪酮應用液（睪酮組）和葵花籽油（對照組）。

持續注射14 d 后，測量每組存活海膽的重量和殼徑，解剖、收集海膽的體腔液，于4℃1 000 r/min離心20 min，分離體腔液上清，保存與超低溫冰箱（-80℃），用于檢測激素含量。收集海膽的消化道和部分性腺于無酶離心管中，液氮速凍后保存于超低溫冰箱（-80℃）中，用于檢測激素含量及基因表達。部分性腺于PFA 中4℃固定過夜用于制作冰凍切片樣品。

1.2.1 性腺組織切片觀察

樣品處理：將包埋后的光棘球海膽性腺樣品用冰凍切片機（LeicaCM1900-1-1）進行冷凍切片；將玻片于37℃烘箱中烘烤1 h。

樣品固定：將烘干的載玻片置于裝滿PBS 的臥式染缸中，室溫搖洗2 次，每次5 min；用4%PFA 固定樣品；隨后用PBS，室溫搖洗2 次，每次5 min，洗去多余的PFA。

染色：將固定后的載玻片用蒸餾水沖洗2～3 min；蘇木精染色15 s；自來水沖洗，洗去浮色；1%鹽酸酒精（1 mL 濃鹽酸加入99 mL70%無水乙醇）分化3～10 s，切片變紅，顏色變淺。

水洗終止分化：自來水搖洗10 min，反藍；伊紅染色1 min；蒸餾水沖洗；70%乙醇30 s；80%乙醇1 min；90%乙醇2 min；甘油封片。

鏡檢：使用Leica DM4B 鏡檢觀察并拍照。

激素測定：采用酶聯免疫吸附技術（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測性腺和體腔液中雌二醇、睪酮和孕酮的含量。按照試劑盒說明書步驟進行測定操作。使用cpectraMax i3x（MOL ECULAR）酶標儀檢測激素含量。

1.2.2 相關基因表達量的測定

總RNA 的提取及cDNA 的合成：參照SV Tolal RNA laolation System（Promaga Z3100）說明書提取總RNA，隨后用瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計（BiochromLtd 公司，英國）檢測RNA 質量。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaRaKa634860）試劑盒將總RNA 反轉錄為cDNA。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書步驟進行。

熒光定量PCR 檢測相關基因的表達：用Light-Cycler96 Instrumen（tRoche，美國）進行實時熒光定量分析dmrt1、foxl2、boule 基因的表達，以Ubiquitin為內參基因。熒光定量PCR 所用引物由http://biotools.nubic.northwestern,edu/OligoCalc.html 網站設計（表1），所用熒光DNA 聚合酶為SYBR Green I Dye。所用體系如下：FastStart Essential DNA Green Master 10 μL，上下游引物各0.8 μL，無菌水6.4 μL，cDNA 2 μL，共20 μL。反應程序為：94℃預變性10 min；94℃15 s，60℃60 s，72℃1 min，35 個循環；72℃延伸10 min。采用2－△△Ct法計算基因的相對表達量。

表1 熒光定量PCR 引物序列Tab.1 Sequence of the primers used for real-time PCR

2 結果與分析

2.1 光棘球海膽性腺及體腔液中性激素的含量

光棘球海膽性腺發育主要分為恢復期、生長期、成熟前期和成熟期四個時期[24]。處于不同發育時期的性腺內各類細胞分布均有所差異。經蘇木精-伊紅染色后，恢復期的性腺中，充滿了染色較淺的營養吞噬細胞，而染色較深、分布稀少的則為卵原細胞和精原細胞；生長期的性腺中，營養吞噬細胞位于生殖腺中部，卵原細胞和精原細胞則排列于生殖腺濾泡壁；在成熟前期性腺中，仍然可見營養吞噬細胞；成熟的卵母細胞和精母細胞開始向生殖腺中央轉移；在成熟期的性腺中，營養吞噬細胞變少，成熟的卵子和精子占據了絕大空間。通過蘇木精-伊紅染色和鏡檢，對光棘球海膽性腺發育情況進行了發育分期判定，檢測了成熟期的雄性（圖1-A 和圖1-B）和雌性（圖1-C 和圖1-D）個體體腔液和性腺中的睪酮、雌二醇以及孕酮的含量。

圖1 光棘球海膽性腺組織學檢測Fig.1 Histological observation of the gonads of sea urchin Mseocentrotus nudus

結果表明，在光棘球海膽的性腺中，睪酮含量存在極顯著的性別差異。精巢中睪酮的含量是卵巢中的2.99 倍（表2）。但是，雌二醇和孕酮在卵巢中的含量顯著高于精巢中，其中卵巢中雌二醇的含量是精巢中雌二醇含量的1.87 倍，孕酮的含量是精巢的2.35 倍（表2）。在光棘球海膽的體腔液中沒有檢測到以上三種激素的存在。

表2 光棘球海膽性腺中雌二醇、睪酮和孕酮的激素的含量Tab.2 Contents of estradiol（E2）,testosterone（MT）and progesterone（PROG）in the gonad of sea urchin Mseocentrotus nudus

2.2 雌二醇處理對光棘球海膽性腺中性別相關基因表達的影響

考慮到睪酮和雌二醇在光棘球海膽性腺中的表達差異顯著，采用注射外源激素的方式探討了性激素在光棘球海膽性腺發育中的功能。持續注射雌二醇14 d 后，熒光定量PCR 檢測表明，光棘球海膽精巢中dmrt1 基因的表達量較對照組顯著降低70.8%；foxl2 基因的表達量與對照組無顯著差異（圖2-A）。dmrt1 基因在對照組與雌二醇處理組卵巢中均不表達；雌二醇處理后，foxl2 和boule 基因的表達量較對照組顯著上調，分別升高了2.25 倍和6.41倍（圖2-B）。

圖2 雌二醇處理對光棘球海膽性腺中性別相關基因表達量的影響Fig.2 Effect of estradiol injection on sex-related gene expression level in the gonads of sea urchin

2.3 睪酮處理對光棘球海膽性腺中性別相關基因表達影響

持續注射14 d 睪酮后，光棘球海膽卵巢中dmrt1 基因在對照組與雌二醇處理組中均不表達，foxl2 基因的表達量較對照組顯著升高約2.66 倍，boule 基因較對照組顯著上調約3.10 倍（圖3-A）；光棘球海膽精巢中dmrt1 和boule 基因的表達量較對照組顯著降低了72.6%和71.0%（圖3-B），foxl2基因的表達量與對照組無顯著差異。

圖3 睪酮處理對光棘球海膽性腺中性別相關基因表達量的影響Fig.3 Effect of testosterone injection on sex-related gene expression level in the gonads of sea urchin

3 討論

本研究利用ELSA 實驗證實，在光棘球海膽精巢和卵巢中均檢測到雌二醇、睪酮和孕酮三種性激素，且存在明顯的性別差異。精巢中睪酮的含量較高，而卵巢中雌二醇和孕酮的含量較高。雌二醇是生物活性最強的雌激素，在維持雌性第二性征中發揮重要作用[25]。哺乳動物黃體產生的孕酮可以與雌激素共同維持雌性生殖系統的正常功能。睪酮對促進性器官發育、精子發生和早期卵泡發育，以及維持第二性征等具有重要意義[26]。濃度為50 ng·L-1以上的甲基睪酮可以有效地提高稀有鯽Gobiocypris rarus 的性腺指數，促進性腺發育[27]。外源性甲基睪酮可以誘導鯔Mugil cephalus L.雄性精子發生與精子形成[28]。海膽Paracentrotus lividus 和海星Asterias vulgaris 配子發育也與性激素水平息息相關[29,30]。性激素可能在光棘球海膽性別分化與性腺發育過程中也發揮類似的重要的調控作用。

外源性激素處理影響物種的性別分化、性腺發育、性別表型等及性別發育信號調控通路中的基因表達。在本研究中，雌二醇和睪酮處理均能顯著降低光棘球海膽dmrt1 基因表達，這與中華鱉及半滑舌鰨中的研究結果一致[19-23]。無論使用雌二醇處理，還是用睪酮處理，均能提高雌性海膽性腺中foxl2基因的表達。高麗麗等發現，雌二醇和睪酮均能促進中華鱉foxl2 基因的表達[20]。這可能是外源性睪酮在海膽體內可能轉化為了雌二醇，使與精巢發育相關的基因表達量下調，而與卵巢發育和維持相關的基因上調表達。雌二醇和睪酮處理均能夠使雌性海膽卵巢中boule 基因的表達量升高。boule 基因作為生殖細胞標記基因，其上調表達意味著生殖細胞數目或者體積增加。在中間球海膽中，注射雌二醇可顯著提高海膽的性腺指數[31]。推測使用雌二醇和睪酮處理可能會促進雌性光棘球海膽的性腺發育。本研究為解析性激素的進化奠定基礎，可為更好地了解雌二醇與睪酮對光棘球海膽性別控制方向的影響，為未來單性養殖棘皮動物提供參考。