梔子苷的提取及酶促水解生產(chǎn)京尼平的研究

李曦杰,鄧月峰,王舉政,陽 杰,黃 晗,李大力

(南京理工大學 生物工程系，江蘇 南京 210094)

梔子是茜草科植物梔子的干燥成熟果實。最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，經(jīng)過現(xiàn)代研究分析，梔子中含有種類繁多的化學成分，梔子苷是梔子果實中的主要生物活性成分之一，屬于環(huán)烯醚萜類化合物，在杜仲和管花肉蓯蓉等植物也有發(fā)現(xiàn)[1-3]。梔子苷有抗炎、利膽、止痛、解熱、輕瀉和鎮(zhèn)靜等作用[4-6]，是梔子抗炎和治療扭挫傷的主要成分，同時其還在植物分類學方面及吲哚生物堿的合成中具有重要意義。梔子苷的提取一般分為兩步，首先需要將梔子果實中的有效成分進行粗提，再將粗提液進行分離純化以得到純度較高的梔子苷。粗提有效成分的技術(shù)一般為煎煮法、超聲提取法、回流法和浸提法等。從梔子果實中粗提出來梔子苷大都含有許多雜質(zhì)，梔子苷的提純方法有活性炭除雜法、硅膠吸附法、鉛鹽沉淀法等。2008年，Liu通過運用柱層析的方法，在最優(yōu)條件下將提取液梔子苷的含量從50%提純至95%[7]。2005年，姚干等采用HPD 450大孔吸附樹脂純化粗提液也得到純度62%以上的梔子苷樣品[8]。梔子苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解可得到京尼平。京尼平是一種環(huán)烯醚萜類化合物，具有保肝利膽、抗癌、鎮(zhèn)痛、降血糖等作用，京尼平還可作為一種新型的天然交聯(lián)劑，能夠與蛋白質(zhì)、明膠和殼聚糖等發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)從而制備生物材料，如梔子藍、梔子紅、凝膠膜等[9-11]。本研究用乙醇浸提梔子果實中的梔子苷，用AB-8大孔吸附樹脂層析純化梔子苷，用固定化β-葡萄糖苷酶對純化后的梔子苷進行酶促水解，獲得了富含京尼平的梔子苷水解液。

1 實驗材料和過程

1.1 材料與試劑

京尼平購自Aladdin公司。AB-8大孔樹脂購自安徽三星樹脂科技有限公司。梔子苷及其他試驗所用試劑均購自國藥集團。高效液相色譜儀為日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 乙醇浸提

用分析天平稱取50 g梔子果實置于家用食品破碎機中，快速破碎5 min。將梔子粉加入400 mL50%乙醇中室溫浸泡48 h，使用尼龍濾布(400目)過濾，濾液收集用于后續(xù)純化。以200 mg·L-1比例加入明礬沉降雜質(zhì)，5 h后用濾紙過濾，收集濾液。

1.3 大孔吸附樹脂純化梔子苷粗提液

將AB-8大孔吸附樹脂加入層析柱，用無水乙醇對層析柱進行淋洗，直至流出的無水乙醇滴入清水中無白色渾濁；用3個柱體積的去離子水洗滌層析柱；將用去離子水稀釋2倍的梔子苷浸取液以1 mL·min-1的流速進樣，上樣完成后使用2個柱體積的去離子水洗滌層析柱；先使用30%乙醇溶液進行洗脫，收集保存洗脫液，然后用50%乙醇溶液再次洗脫層析柱，保存洗脫液。

1.4 酶促水解梔子苷粗提液

參照Ouyang[12]等人的報道制備以殼聚糖為載體的β-葡萄糖苷酶(殼聚糖@β-葡萄糖苷酶)。將0.1 g殼聚糖@β-葡萄糖苷酶加至5 mL含有磷酸鹽緩沖液(pH 6.0，50 mM)中，隨后加入5 mL 50%乙醇洗脫物，50℃反應(yīng)12 h后，離心分離殼聚糖@β-葡萄糖苷酶。上清液為梔子苷水解液。

1.5 TLC與HPLC分析

用薄層層析(TLC)定性檢測梔子苷和京尼平，展層劑為氯仿：甲醇= 4：1(v/v)。用高效液相色譜(HPLC)對梔子苷含以及京尼平含量進行定量分析，檢測波長為260 nm，流動相為甲醇：水= 40：60(v/v)，流速為0.4 mL·min-1。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 梔子苷的提取結(jié)果

梔子苷分離純化各步驟樣品的HPLC分析結(jié)果如圖1。從HPLC分析結(jié)果中可以看到，乙醇對梔子果實進行浸提，浸取液中雜質(zhì)較多。30%乙醇洗脫層析柱，洗脫物中含大部分雜質(zhì)，同時也含有少量梔子苷，而50%乙醇再次洗脫后，洗脫物中梔子苷的純度較高，雜質(zhì)較少。計算得到50%乙醇洗脫物中梔子苷濃度為1.495%，梔子中梔子苷的提取收率為1.79%。經(jīng)層析純化處理后的梔子苷液(右)與標準樣(左)的TLC結(jié)果如圖2，左側(cè)為梔子苷標準樣；右側(cè)為樹脂純化后的梔子苷，可觀察到AB-8大孔吸附樹脂層析對梔子苷純化效果較好。

圖1 梔子苷分離純化各步驟樣品的HPLC分析圖

圖2 梔子苷的TLC分析結(jié)果

2.2 酶水解梔子苷的結(jié)果

HPLC和TLC檢測殼聚糖@β-葡萄糖苷酶對梔子苷的水解反應(yīng)液中梔子苷與京尼平的含量變化如圖3-4，圖4中左側(cè)為京尼平標準樣；中間為水解1h反應(yīng)液；右側(cè)為水解12 h反應(yīng)液。反應(yīng)剛開始時溶液中無京尼平，反應(yīng)進行1 h后，反應(yīng)溶液中的梔子苷含量下降，京尼平生成。反應(yīng)12 h后，反應(yīng)液上清為含有大量京尼平的梔子苷水解液。

圖3 殼聚糖@β-葡萄糖苷酶水解純化梔子苷反應(yīng)溶液HPLC分析

圖4 梔子苷酶促水解液的TLC分析結(jié)果

3 結(jié) 論

采用乙醇對梔子果實中的梔子苷進行浸提后，利用AB-8大孔吸附樹脂對梔子苷進行純化，獲得的梔子苷經(jīng)殼聚糖@β-葡萄糖苷酶水解12 h后即可獲得富含京尼平的水解液。可離心去除殼聚糖@β-葡萄糖苷酶以避免蛋白對制備液的污染。這種制備京尼平的方法簡單有效且對環(huán)境友好。