不同試劑盒檢測急性肝胰腺壞死病比對與分析

莫鉆蘭 李 敏 黃炳熾 彭家杰 洪偉彬 胡健聲 黃潔瑩

廣東省東莞市動物疫病預防控制中心，廣東東莞523000

急性肝胰腺壞死病（acute hepatopancreatic ne?crosis disease，AHPND），因其主要發(fā)生于蝦苗放養(yǎng)后7～30 d，又名早期死亡綜合征（early mortality syn?drome，EMS）[1-2]，死亡率可達100%[3]，是近年來出現(xiàn)的一種新型致命性的細菌性疾病，主要危害凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）和中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）。該病最早于2010年被發(fā)現(xiàn)，近年來，馬來西亞、越南、泰國、菲律賓、墨西哥等國家相繼有所報道[4-9]，使全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)每年損失近10 億美元[10]，嚴重影響了對蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

血清學分型、生化鑒定是檢測鑒定細菌的經(jīng)典方法，郭書林等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF-MS 檢測效率高于生化鑒定方法，與PCR 結(jié)合使用更有利于急性肝胰腺壞死病的診斷和監(jiān)測。隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多商品化的實時熒光定量PCR檢測試劑盒被研發(fā)出來。本研究就本實驗室參加的急性肝胰腺壞死能力測試的樣品來對比和分析不同商品化熒光定量PCR 試劑盒檢測結(jié)果的一致性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）樣品。此次待檢樣品和陽性標準物質(zhì)均由中國水產(chǎn)研究院黃海水產(chǎn)研究所（以下簡稱黃海所）提供。8 份樣品均保存于95%乙醇中，編號為107873、107231、107122、107512、107243、107235、107431、107233。

2）試劑。海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒（批號：S8107）購自天根；引物探針（批號：111516527）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；預混液（批號：AK11116A）購自Takara；3 種商品化的對蝦肝胰腺壞死熒光PCR 檢測試劑盒分別來自不同生產(chǎn)廠家：A（批號：200417）、B（批號：67054）、C（批號：JC0003202006）。

3）儀器設(shè)備。生物安全柜，高速離心機，熒光PCR儀。

1.2 方 法

1）本次能力測試要求的檢測方法。按照黃海所下發(fā)的《病原測試項目作業(yè)指導書》，依據(jù)SC/T 7233-202X《急性肝胰腺壞死病診斷規(guī)程》（報批稿）進行試驗分析。

①核酸提取。使用天根DNA 提取試劑盒，依其說明書提取急性肝胰腺壞死病毒的核酸。

②qPCR 檢測。按表1 中引物和探針配置qP?CR 反應(yīng)體系，分裝到PCR 管中，分別加入樣品模板DNA，陰性對照和陽性對照。混勻離心后，置于熒光定量PCR 儀中。按表1 中的反應(yīng)程序進行擴增，25 μL PCR 反 應(yīng) 體 系，包 括：2×PCR Premix（Probe qPCR）12.5 μL、引物VpPirA-F（10 mol/L）0.75 μL、引物VpPirA-R（10 mol/L）0.75 μL、Taq?man Probe（10 mol/L）0.25 μL、模板DNA（濃度：50～100 ng/μL）1 L、滅菌雙蒸水9.75 μL。結(jié)果判定標準詳見表2。

表1 qPCR檢測的引物、探針、反應(yīng)程序和時間

表2 試驗結(jié)果判定標準

2）商品化的急性肝胰腺壞死實時熒光定量PCR 檢測。以本次參測盲樣為樣品，從市場上選取3家不同廠家生產(chǎn)的實時熒光定量PCR 檢測試劑盒檢測（由A、B、C 代替）進行試驗與分析，3 種試劑盒的試驗成立標準、結(jié)果判定標準各不相同（表3）。按照各自試劑盒說明書配制熒光PCR 反應(yīng)體系，依次加入陰性對照、樣品核酸和陽性對照，加樣后及時蓋緊管蓋，做好標記，混勻后離心，按照各自的反應(yīng)程序擴增。

表3 不同試劑盒的反應(yīng)體系、反應(yīng)時間、試驗成立和結(jié)果判定標準

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸檢測結(jié)果

依據(jù)《SC/T 7233-202X》（報批稿）方法對樣品進行試驗分析。如圖1所示，陽性質(zhì)控Ct值為22.65且有典型的S 型曲線，陰性對照無Ct 值，試驗成立。樣 品107243、107431、107235、107231、107873 在FAM 通道有典型的擴增曲線且Ct 值分別為15.09，28.14，32.64，33.15 和33.5，樣 品107122、107233、107512 均無Ct 值。因此，可判樣品107243、107431、107235、107231、107873 為Vahpnd 核酸陽性，樣品107122、107233、107512 為Vahpnd 核酸陰性，檢測結(jié)果為滿意。

圖1 Vahpnd的擴增曲線圖

2.2 商品化的急性肝胰腺壞死實時熒光定量PCR結(jié)果

各試驗陰、陽對照符合說明書的試劑成立標準，試驗均成立。但是，只有A、C 與對比試驗結(jié)果一致，B均未檢出陽性盲樣（圖2）。如表3所示，C試劑的反應(yīng)時間較A 略快，分別是56 min 和66 min。設(shè)定相同閾值時，A 試劑檢測的5 個陽性樣品的Ct值要略小于C試劑（表4）。

圖2 不同試劑的擴增曲線圖

表4 設(shè)定相同閾值時，A、C試劑檢測出的陽性樣品的Ct值

3 討 論

本次能力驗證的檢測依據(jù)《SC/T 7233-202X《急性肝胰腺壞死病診斷規(guī)程》（報批稿）》中可以采用商品化探針法qPCR，但也同時強調(diào)的是需要有同等效果。本次試驗發(fā)現(xiàn)，市場上3 種商品化熒光定量qPCR 試劑盒，A和C的檢測結(jié)果符合能力驗證的結(jié)果，因此，實驗室在選用商品化試劑盒時需要做試劑比對，更有利于確保檢測數(shù)據(jù)的準確性。

本次試驗設(shè)置相同的閾值為20，A 試劑的Ct 值偏小。研究發(fā)現(xiàn)：Ct 值與該DNA 模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)呈反比[12]，但是，A 試劑加入的模板量大于C 試劑，因此，不能判斷A 試劑的靈敏度高于C 試劑。對比A、C試劑擴增曲線圖，發(fā)現(xiàn)A 試劑在40個循環(huán)后還出現(xiàn)了緩慢增長的趨勢，C 試劑更接近S形，可推測為A 試劑的反應(yīng)液還有較充足的離子、酶、能量等。這是因為隨著PCR 循環(huán)的增多，產(chǎn)物增長的速度逐漸減緩，待所有的dNTP、酶等被基本用盡后，擴增曲線就進入了平臺期[13]。結(jié)合表1 和表3，標準方法的反應(yīng)時間是60 min，A 試劑的反應(yīng)時間為66 min，C 試劑的反應(yīng)時間為56 min。在實際工作中，如果想盡快得到檢測結(jié)果，可選C試劑。