蛤蚧冬眠期與非冬眠期消化道嗜銀細胞的比較

趙成堅 黃 勇 劉 武 徐永莉 姜建萍 霍 娟*

1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530200

消化道不僅是動物機體主要的消化器官，也是體內最大、最復雜的內分泌器官，其組織中含有種類繁多、功能各異的內分泌細胞，嗜銀細胞是其中的一種，與神經(jīng)系統(tǒng)和外分泌腺相互配合，共同調控消化吸收及體內其他生理過程。已有不少學者對哺乳動物如山羊[1]、豬[2]、金錢豹[3]，鳥類如黃雀[4]、鵪鶉[5]，魚類如花[6]，爬行動物如烏蘇里蝮蛇[7]、草蜥[8]、胎生蜥蜴[9]等動物的消化道嗜銀細胞進行研究，研究結果表明：不同種類動物消化道嗜銀細胞的類型及分布存在較大差異，同種類的動物如爬行動物既有差異也有相似性，但不是絕對相同，與食性及棲息地環(huán)境有一定的關系[10]。

蛤蚧屬于脊索動物門、爬行綱、有鱗目、壁虎科、壁虎屬動物，為我國傳統(tǒng)的珍稀瀕危動物藥材，具有調節(jié)免疫、抗腫瘤、平喘、抗炎及抗衰老等作用。主要分布于我國的廣西、廣東和云南南部及越南、緬甸北部。每年11月至第2年3月底，氣溫低于18 ℃時，蛤蚧進入冬眠期，此時的蛤蚧少進食或者不進食，活動量明顯減少。已有學者對兩棲綱蛙類如林蛙[11]、中華蟾蜍、黑斑蛙[12]在冬眠期與非冬眠期的消化道嗜銀細胞進行研究，而爬行綱變溫動物蛤蚧在冬眠期與非冬眠期消化道嗜銀細胞的研究至今未見報道。本文擬對這2個時期的蛤蚧消化道嗜銀細胞進行比較研究，以期為探討嗜銀細胞是否參與冬眠期的消化調節(jié)活動提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試驗動物。本試驗所用的蛤蚧來自廣西壯族自治區(qū)藥用植物園養(yǎng)殖基地，體格健康，雌雄不限，平均體重約60 g。冬眠期取樣時間為1月，非冬眠期取樣時間為6月，每個時期樣本數(shù)為3條。

2）試驗試劑。Bouin 固定液：40%甲醛溶液25 mL，冰醋酸5 mL，苦味酸飽和水溶液70 mL；硝酸銀染液：1%硝酸銀水溶液5 mL，0.2 mol/L 醋酸鈉緩沖液（pH 5.6）10 mL，雙蒸水85 mL；還原液：無水亞硫酸鈉5 g，對苯二酚1 g，雙蒸水100 mL；5%硫代硫酸鈉水溶液。

1.2 方 法

1）取樣。取冬眠期與非冬眠期的蛤蚧各3 條，采用毀髓法（解剖針從頭頸部插入搗毀腦組織和脊髓）處死，解剖將胃部及腸道取出，用0.9%生理鹽水沖洗。分別取胃賁門、胃體、胃幽門、十二指腸、空腸、回腸，每段約0.5 cm，浸泡于Bouin 固定液中48 h，然后流水沖洗幾次，放入70%乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

2）石蠟切片。將材料取出，流水沖洗后進行常規(guī)石蠟切片步驟，即脫水、浸蠟、包埋、修塊、切片。

3）脫蠟至水。依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min→二甲苯Ⅱ20 min→無水乙醇Ⅰ5 min→無水乙醇Ⅱ5 min→75%乙醇5 min，自來水洗，再用蒸餾水洗3次。

4）染色及還原。在60 ℃硝酸銀染液恒溫浸染3 h 后，用紙吸干組織周圍的染液。放入45 ℃還原液中還原1 min，蒸餾水洗2 次，5%硫代硫酸鈉水溶液2 min，蒸餾水洗數(shù)次。

5）脫水封片。切片依次放入無水乙醇Ⅰ5 min→無水乙醇Ⅱ5 min→無水乙醇Ⅲ5 min→二甲苯Ⅰ5 min →二甲苯Ⅱ5 min 透明，中性樹膠封片。

6）顯微鏡檢及細胞計數(shù)。在200倍光鏡下對冬眠期與非冬眠期的蛤蚧的食道、胃體、胃幽門、十二指腸、空腸、回腸等6個部位嗜銀細胞的分布情況進行觀察，每個時期每個部位選取5個視野，用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件中的Duncan's 多重比較的方法對不同時期消化道各部位嗜銀細胞密度進行統(tǒng)計學分析，并運用t檢驗對同一部位不同時期的嗜銀細胞密度進行統(tǒng)計學分析，取“平均值±標準差”表示樣本嗜銀細胞的分布數(shù)量。

2 結果與分析

由于嗜銀細胞有親銀的特性，經(jīng)過銀染液染色后，嗜銀細胞呈黑色或棕黑色，背景為黃色或淺黃色，在光鏡下對比較為明顯，容易辨認。

2.1 嗜銀細胞的形態(tài)特征

從切片鏡檢的結果來看，冬眠期蛤蚧消化道嗜銀細胞的形態(tài)主要以不規(guī)則形、椎體形為主，而非冬眠期蛤蚧消化道嗜銀細胞形態(tài)主要以橢圓形、長梭形、圓形為主，主要分布于黏膜上皮細胞之間、上皮細胞基部及腺部上皮細胞之間，2 個時期的形態(tài)特征及分布密度見圖1～圖8。

圖1 冬眠期蛤蚧食道嗜銀細胞

圖2 非冬眠期蛤蚧食道嗜銀細胞

圖3 冬眠期蛤蚧胃體嗜銀細胞

圖4 非冬眠期蛤蚧胃體嗜銀細胞

圖5 冬眠期蛤蚧幽門嗜銀細胞

圖6 非冬眠期蛤蚧幽門嗜銀細胞

圖7 冬眠期蛤蚧十二指腸嗜銀細胞

圖8 非冬眠期蛤蚧十二指腸嗜銀細胞

2.2 冬眠期與非冬眠期蛤蚧嗜銀細胞的分布情況及密度

冬眠期蛤蚧胃部的嗜銀細胞分布密度高峰位于幽門，低谷位于胃體；腸道部的嗜銀細胞分布高峰位于十二指腸，低谷位于回腸。非冬眠期的分布高峰在食道。同一部位處于不同時期時的嗜銀細胞分布密度差異極顯著，冬眠期各個部位的嗜銀細胞數(shù)量明顯高于非冬眠期的數(shù)量（表1）。

表1 蛤蚧冬眠期與非冬眠期消化道各段嗜銀細胞的密度

3 討 論

蛤蚧作為沒有口腔咀嚼能力的變溫動物，其胃腸道消化能力特別強，可將成型的昆蟲如蝗蟲、土鱉蟲、蟑螂的角質消化吸收，并且具有極強的耐饑餓能力，在長達3～4 個月的冬眠期間可不進食，可見其胃腸道內分泌細胞在營養(yǎng)吸收和能量轉化過程中扮演十分重要的角色。作為主要的消化道內分泌細胞——嗜銀細胞以分泌5-HT 為主，具有調節(jié)黏液分泌、胃腸蠕動、平滑肌收縮和血管擴張的功能。從組織切片結果來看，在各個時期從胃部到腸道均可看到有嗜銀細胞分布，食道與胃幽門嗜銀細胞的分布密度明顯高于胃體，呈“U”形分布，這與王曉平等[13]報道的結果相一致。食物經(jīng)過食道及胃賁門的擠壓進入胃體，食道的嗜銀細胞在感受吞食時機械壓力刺激分泌激素，對食物起潤滑和反饋調節(jié)作用，同時防止食物及胃液反流入食管。胃幽門控制胃的排空速度，因此需要更多的嗜銀細胞參與調節(jié)[14]。華子暄等[15]將哺乳動物嗜銀細胞在小腸的分布規(guī)律歸納為3 種類型，即第1 種類型是在十二指腸處嗜銀細胞分布的數(shù)量最多，然后分布數(shù)量逐漸降低，在回腸處最低。目前，依據(jù)所研究的爬行動物消化道內嗜銀細胞的分布情況，約有2/5 的物種分布密度高峰位于胃幽門[16]。蛤蚧便是其中之一。第2 種類型是嗜銀細胞在小腸形成一個“U”形的密度分布曲線，即空腸處數(shù)量極少，而十二指腸與回腸處數(shù)量多。楚德昌等[12]對中華蟾蜍的研究結果屬于這種類型。第3種類型是嗜銀細胞在小腸中的分布呈高低變動的波浪形，王淼等[14]對東亞腹鏈蛇的研究結果屬于這一類型。

從研究結果看，蛤蚧在不同時期消化道內的嗜銀細胞形態(tài)各異，冬眠期嗜銀細胞的形態(tài)特征主要以不規(guī)則形、椎體形為主，非冬眠期嗜銀細胞的形態(tài)特征主要以圓形、橢圓形為主；蛤蚧冬眠期消化道各部位的嗜銀細胞分布密度顯著高于非冬眠期的各部位器官，這結果與同屬于爬行綱有鱗目動物胎生蜥蜴[16]在饑餓狀態(tài)下嗜銀細胞分布情況相似，也與楚德昌等[12]對冬眠期與非冬眠期的中華蟾蜍和黑斑蛙消化管嗜銀細胞的研究結果相似，表明冬眠期動物消化道活動雖然明顯減弱，但其分泌機能儲備反而有明顯增加，但與王鴿等[17]對饑餓小鼠嗜銀細胞的研究結果存在差異。由此可見，禁食處理及冬眠這一生物學行為特性對嗜銀細胞的分泌會因物種的不同而有不同的影響，與食性、環(huán)境溫度等因素相關。

冬眠是指一些動物在冬季隨體溫和代謝降低從而呈現(xiàn)出一種昏睡的狀態(tài)，是對季節(jié)性能量短缺的一種生理適應。在人工飼養(yǎng)條件下，雖然可以人為提供充足的食物，但由于環(huán)境溫度的降低及自身的生物學特性，蛤蚧停止了進食及活動，機體體溫被調節(jié)到接近于環(huán)境溫度的水平，心率、代謝率及其他生理活動也相應降低。長時間的低溫和禁食，嚴重影響腸道的正常功能和腸道菌群結構。目前，對于引發(fā)蛤蚧冬眠的機制尚未明確，有待進一步研究。