基于UHPLC-MS/MS法測(cè)定雪蓮中的蘆丁和綠原酸含量*

白瑪央宗 白瑪拉珍 玉珠拉姆 馬超**

（1.西藏自治區(qū)高原生物研究所；2.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西藏 拉薩 850000）

雪蓮是菊科風(fēng)毛菊屬的植物(Saussurea DC),是西藏地區(qū)常見(jiàn)的土特產(chǎn)類藥材，雪蓮有雪蓮花(SI)、苞葉雪蓮(SO)、綿頭雪兔子(SL)、水母雪兔子(SM)、星狀雪兔子(SS)和三指雪兔子(ST)等80個(gè)品種,大部分品種主要分布在青藏高原及其毗鄰地區(qū)，包括尼泊爾和印度等地，俄羅斯也有分布[1-3]。雪蓮作為一種名貴的藥材主要是指雪蓮花(SI),《月王藥診》和《木草綱目拾遺》均有對(duì)天山雪蓮(SI)的記載。雪蓮集中生長(zhǎng)在海拔較高的流石灘地區(qū)，裸露的特殊的生境，容易被發(fā)現(xiàn)，盡管海拔高但是容易采挖，一度瀕危[4]。

研究顯示雪蓮有良好的消炎止痛、抗腫瘤、抗氧化、降血脂等作用[5]，并含有如黃酮類、木脂素類、酚醛類、苯丙素類和倍半萜類化合物等生物活性物質(zhì)[6-8]。現(xiàn)行中國(guó)藥典采用HPLC 法測(cè)定天山雪蓮中蘆丁和綠原酸含量作為標(biāo)準(zhǔn)[9]；達(dá)娃卓瑪?shù)炔捎肏PLC-DAD–ESI-MSn分析了不同產(chǎn)地三指雪兔子中8 種物質(zhì)的含量[10]，以期達(dá)到規(guī)范檢查方法并應(yīng)用到其他品種的目的；王強(qiáng)等采用高效液相色譜法測(cè)定10 批不同產(chǎn)地天山雪蓮中綠原酸和蘆丁的含量[11]；史俊友等采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 比色法對(duì)大苞雪蓮、綿頭雪蓮及水母雪蓮中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定[12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)UHPLC-MS/MS 法對(duì)不同來(lái)源雪蓮中的藥典標(biāo)志性成分含量進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià)，篩選優(yōu)質(zhì)雪蓮藏藥材，以期為雪蓮質(zhì)量控制和針對(duì)性保護(hù)開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

20 份雪蓮樣品，其中1～15 號(hào)購(gòu)自拉薩、林芝等地的農(nóng)牧民及特產(chǎn)店，16～19 號(hào)樣品為課題組于2020 年7月采集，標(biāo)本現(xiàn)存于西藏自治區(qū)高原生物研究所，20號(hào)為天山雪蓮。

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)綠原酸和蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨都為色譜純，均購(gòu)自百靈威科技有限公司。

1.3 儀器試劑

Waters Xevo TQ-S+ACQUITY UPLC 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Waters 公司）；TG 16 臺(tái)式高速離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司)；MILLI-Q INTEGRAL 15 純水/超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore 公司)；CPA225D 電子天平(德國(guó)Sartorius 公司)；LD-500 搖擺式中藥粉碎機(jī)（長(zhǎng)沙市常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠）；HYC-356醫(yī)用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司）；Eppendorf移液器（德國(guó)艾本德有限公司）；KQ5200DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XW-80A 旋渦混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液制備。樣品采用中藥粉碎機(jī)粉碎，用天平稱取樣品粉末0.10g，溶于10mL80%甲醇中，渦旋混勻后超聲提取40min，補(bǔ)足減失質(zhì)量，室溫下8000rpm 離心5min，取上清液經(jīng)0.22μm 微孔濾膜濾過(guò)，用80%甲醇分別稀釋10 倍、100 倍、1000 倍，然后轉(zhuǎn)移至96孔進(jìn)樣板進(jìn)樣。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。精密稱取蘆丁、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別置于10mL棕色容量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，配成便準(zhǔn)品溶液。次稀釋該標(biāo)準(zhǔn)溶液得到一系列校準(zhǔn)溶液。

以上溶液均置于4℃冰箱冷藏備用。

2.2 色譜質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件。色譜柱：ACE Excel-2 C18-PFP 色譜柱(100mm×2.1mm,2.6μm)；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水（含5mM甲酸銨），流動(dòng)相B：甲醇（含5mM甲酸銨），梯度洗脫5.5min。柱溫：35℃，進(jìn)樣量3μL，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 質(zhì)譜條件。離子源電噴霧離子源（ESI），正離子模式；噴霧毛細(xì)管電壓：3.0KV；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流速：800L/Hr；離子源溫度：150℃；掃描模式：MRM；綠原酸和蘆丁的離子對(duì)信息見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限試驗(yàn)

取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)并得到回歸方程；通過(guò)其信噪比來(lái)計(jì)算檢出限和定量限，檢測(cè)限和定量限分別在信噪比為3 和10 時(shí)測(cè)定。結(jié)果顯示蘆丁和綠原酸線性關(guān)系良好，靈敏可靠，見(jiàn)表3。

表3 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.1.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液適量，在“2.2”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各待測(cè)成分的峰面積，以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果（表4）顯示均小于3%，表明該方法精密度良好。

表4 精確度、重復(fù)性、穩(wěn)定性

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

根據(jù)“2.1.1”項(xiàng)下的方法，取同一樣品制備6 份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)定各成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果（結(jié)果）顯示均小于5.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液適量，室溫下放置，第1 天、第2 天、第3 天分別按“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣，記錄各成分峰面積并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果顯示，都小于3.4%，表明上述溶液穩(wěn)定性良好。

2.7 加標(biāo)回收率

取混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算平均回收率，結(jié)果（表5）顯示各成分平均回收率為90%～108%，RSD 小于3.4%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。

表5 加標(biāo)回收率

2.8 含量測(cè)定

取不同的雪蓮樣品適量，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，平行測(cè)定3 次，測(cè)定各樣品中綠原酸和蘆丁的含量，結(jié)果（表6）發(fā)現(xiàn)20份雪蓮樣品都含有較高含量的綠原酸，其中采自察隅縣的18 號(hào)雪蓮樣品的綠原酸含量最高（10692.1μg/g），而蘆丁含量相差較大，天山雪蓮的蘆丁含量最高（6468.821μg/g），1、4、10、17雪蓮樣品幾乎不含蘆丁。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究建立了不同來(lái)源西藏雪蓮中蘆丁和綠原酸含量的UHPLC-MS/MS 測(cè)定方法，并與同樣測(cè)定方法下的天山雪蓮進(jìn)行對(duì)照比較，發(fā)現(xiàn)天山雪蓮的蘆丁含量占優(yōu)勢(shì)，而西藏雪蓮的綠原酸含量普遍較高且有4 個(gè)樣品的綠原酸含量高于天山雪蓮。中國(guó)藥典（2020 年版）要求天山雪蓮中無(wú)水蘆丁和綠原酸的含量均不得少于0.15%，采自察隅縣的18 號(hào)雪蓮樣品滿足這一條件的同時(shí)，綠原酸含量明顯高于天山雪蓮樣品。為雪蓮的深入研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考的同時(shí)，為其質(zhì)量控制提供了一種新的模式。