ATP生物熒光技術在肉品生產在線清潔度監測中的可行性研究

黃 炎，張文平，凌艷明

（1.明尼蘇達礦業制造醫用器材（上海）有限公司，上海200233；2.山東新希望六和集團有限公司，山東 青島266102；3.濰坊和盛園食品有限公司，山東 濰坊262127）

ATP（三磷酸腺苷）是一種化學物質，存在于所有活生物體的細胞中，含1分子腺嘌呤、1分子核糖和3個相連的磷酸基團構成的高能磷酸化合物。McElroy W D[1]最早實現了化學能向光能的轉化。細胞受損或死亡時，其ATP值迅速下降或消失，因此ATP濃度和活細胞數密切相關[2]?？梢酝ㄟ^化學反應[1]來檢測細胞內源性ATP含量，反應活細胞數量：

ATP+D-Luciferin+O2→Oxyluciferin+AMP+PPi+O2+Light

目前，多數的文獻圍繞醫療器械清洗效果展開[3-5]，表明ATP可作為快速檢驗可重復醫療器械清洗效果和醫務人員手衛生質量的評價。ATP檢測技術在食品工業的多個領域也有采用，如脫水蔬菜和調味品的含菌量測定[6]、農副產品輻照滅菌效果測定[7]、啤酒中菌落總數的快速測定[8]、肉制品新鮮度快速測定[9]等。

食品加工過程需要對清洗效果進行判讀，主要有感官判斷、微生物培養和ATP生物熒光檢測。但利用涂抹工具與平板培養法共用的方法來檢測表面的微生物不能滿足食品生產環境實時監測（HACCP）管理要求。ATP生物熒光檢測方法較瓊脂培養法具有靈敏度高、無需大量人員、無需額外的準備、收尾工作及操作簡便、需要時間短等特點[10]。國內外已有部分文獻論述ATP生物熒光檢測法與瓊脂平板計數法存在相關性，但對于肉品加工環境的應用效果和經濟效益并無論述，試驗采用ATP生物熒光檢測法與瓊脂平板計數法對肉品加工環境下的人員手部清潔度和設備實施清潔度的情況進行對比評估，預期兩者存在一定的相關性，為肉品行業在線實時監控提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗儀器

3MTMClean TraceTM熒光檢測儀（LM1）、3MTMClean TraceTM表面ATP涂抹棒（UXL 100）、無菌棉拭紙棒、一次性無菌培養皿、刻度吸管、刻度試管、高溫高壓滅菌鍋、培養箱、菌落計數培養基。

1.2 取樣點

某車間生產環境位點7個及員工手部。

1.3 現場采樣方法

1.3.1 ATP生物熒光檢測的采樣方法

取出冷藏于冰箱內的包裝袋在室溫下放置10 min后，從3MTMClean TraceTM表面ATP涂抹棒中取出采樣棒，對位點進行充分涂抹。

1.3.2 ATP生物熒光檢測的檢測方法

涂抹后，采樣棒插入裝置，用力向下推壓藍色手柄使采樣棒充分插入，并迅速振蕩涂抹棒5 s以激活和混合反應體系。打開3MTMClean TraceTM熒光檢測儀樣品蓋，將激活后的涂抹棒插入裝置中，點擊儀器屏幕上的檢測按鈕，開始檢測，10 s后判讀RLU結果。

1.3.3 微生物涂抹的采樣方法

用浸有無菌生理鹽水的棉拭紙棒對同一位點進行充分涂抹后，將接觸部分折斷，剩余棉拭紙棒放入盛有9 mL無菌生理鹽水的試管中，帶回實驗室進行稀釋、培養與計數。

1.3.4 微生物涂抹的檢測方法

將試管振蕩后，吸取1 mL原液加入盛有9 mL的無菌生理鹽水試管中，稀釋成1∶10的稀釋液，再吸取1∶10稀釋液加入到9 mL無菌生理鹽水的試管中，混勻成1∶100的稀釋液。在上述稀釋度中各取1 mL加入到無菌培養皿中，然后傾注15~20 mL無菌菌落計數培養基到無菌平皿中，并旋轉平皿，使菌懸液和瓊脂進行充分混勻。待瓊脂冷卻凝固后，倒置平皿，底部朝上，置于36℃恒溫培養箱中培養48 h后，進行菌落總數計數。

1.3.5 微生物計數方法

培養到時間后，計數每個平板上的菌落數。按照GB 4789.2中的相關規定進行判讀、計算和結果報告。

1.4 數據統計分析

試驗數據采用Excel建立數據庫，運行SPSS統計軟件對數據進行統計分析。分別分析RLU的對數值和菌落總數對數值進行統計學線性相關分析和線性回歸分析。

2 結果與分析

2.1 洗手后菌落總數和熒光值檢測結果

員工洗手后ATP生物熒光法和瓊脂法的檢測結果見表1。

表1 員工洗手后ATP生物熒光法和瓊脂法的檢測結果

由表1可知，RLU值和菌落總數結果呈一定的線性關系。以RLU值的對數值為X軸，菌落總數的對數值為Y軸，作散點圖（圖1），作統計學線性分析得出回歸方程Y=1.286 4X-3.024 4，R2=0.930 8，p<0.001，具有統計學意義。也就是說，兩者具有線性回歸關系，說明對于員工手部清洗效果用RLU值可以預測菌落總數結果，及時反饋手部清洗消毒后效果。

手部清洗后RLU對數值與菌落總數對數值的線性關系見圖1。

圖1 手部清洗后RLU對數值與菌落總數對數值的線性關系

2.2 設備表面菌落總數和熒光值檢測結果

設備表面一共采集了105個樣本，其中73個樣本在結果判定中完全一致（2種方法同時小于限值或同時大于限值的檢樣數），23個樣本ATP涂抹結果超標而微生物涂抹合格，5個樣本微生物涂抹超標而ATP涂抹結果合格。清洗消毒后，將微生物結果有意義的39個環境表面涂抹的結果（ATP熒光值和微生物結果）進行對數值轉換，以RLU值的對數值為X軸，菌落總數的對數值為Y軸，作散點圖（圖2），作統計學線性分析得出回歸方程Y=0.337 4X+0.905 4，p<0.001，具有統計學意義。也就是說，兩者具有線性正相關關系，說明熒光值越高，微生物的風險越高。

設備清洗后RLU對數值與菌落總數對數值的線性關系見圖2。

圖2 設備清洗后RLU對數值與菌落總數對數值的線性關系

2.3 ATP在車間環境應用的可行性結果

假設傳統方法檢測一個樣品的材料費為3元，ATP檢測一個樣品的材料費為18元。傳統方法需要2個人工進行操作，人工成本為3 000元/月；而ATP方法需要現場質量操作工隨時操作，免去額外的人工成本。對于傳統方法還需要制備培養基所需的洗刷滅菌等操作帶來的水電費用，為300元/月。ATP檢測儀的折舊費定為2 000元/年。假設單個工廠每個月需要涂抹N個樣品，則傳統方法一年需要的檢測費用為39 600+36 N。而ATP涂抹方法一年需要的檢測費用為2 000+216 N。當N<208個樣品時，使用ATP涂抹的成本會比傳統涂抹方法的成本更低。

3 結論

3.1 ATP生物熒光檢測法對手部清洗效果的評價

由圖1可知，RLU值和菌落總數值之間具有一定的正相關性，p<0.001，說明具有統計學意義。RLU值表征的是清洗效果，清洗質量是消毒成功的前提，大量的文獻表明，消毒前對設備進行有效清洗，可以使細菌數量和有機物明顯降低，否則會造成滅菌過程失敗[11-12]。在醫療衛生行業，有較多的文獻表明ATP熒光檢測方法和細菌培養法對手衛生消毒效果結果一致，且ATP生物熒光方法可以在現場直觀、快速得出結果，對醫務人員教育意義較大，提高醫務人員參與感控的積極性[5，13-14]。同樣，在食品加工環節中，人是影響食品質量的一個重要因素，利用ATP熒光檢測方法可以在現場實時得出結果，提高企業所有員工參與質量提升的主動性。

3.2 ATP生物熒光檢測法對加工設施清潔度的評價

由圖2可知，RLU值和菌落總數之間具有一定的正相關性，p<0.001，具有統計學意義。食品生產設施表面對食品生產的質量起到非常重要的作用，特別是食品直接接觸面。劉陽等人[15]研究表明，ATP生物熒光檢測計數測定的熒光值和物體表面的菌落總數情況存在良好的相關性，且ATP值不合格的點，其對應的平板計數的結果也會不合格。在試驗中，2種方法分別判定是否合格的一致率達到78.23%。另外，檢測點ATP值高，其24 h后必然大量滋生細菌而導致嚴重污染。目前，ATP生物熒光檢測方法雖然應用于食品行業多年，但未有報道關于其在食品行業中的詳細評價結果。但從ATP生物熒光檢測方法在醫療器械清洗效果的評估中，可以看到ATP生物熒光檢測方法可以快速評估清洗效果，且利于提高清洗質量[3-4]。

3.3 引入ATP生物熒光檢測法對運營成本的影響

有文獻指出，ATP生物熒光檢測技術存在一定的局限性，如耗材為一次性且價格昂貴，食品企業負擔不起[10]。如果單純從耗材角度看，ATP生物熒光檢測方法的價格的確會比平板檢測貴，但綜合樣品制備、人員配置、檢測時間等因素考慮，在一定檢測量下，ATP生物熒光檢測方法可以帶來的經濟效益較平板培養法更大。

食品工業中的ATP生物熒光檢測的內容包括微生物和食品殘渣[16]。清洗是食品加工過程中的核心步驟，保證清洗效果可以進一步確保消毒效果。ATP來源于活細胞，活細胞不僅存在于微生物中也存在于食品殘渣中，食品殘渣更是微生物滋生的重要來源。因此，將ATP生物熒光檢測方法和微生物培養皿方法一起使用，ATP生物熒光檢測法確定清洗效果，而微生物培養皿方法確定消毒效果及微生物污染的種類和來源。ATP生物熒光檢測方法是一種主動控制污染事故發生的有效方法[17]，其優點在于根據檢查結果，符合HACCP監測要求，現場確認污染情況并數值化，對于生產環節的現場處理提供了可靠的依據，提出具有說服力的指導。利用軟件系統可以追蹤位點監測結果變化趨勢，防患于未來。有文獻報道，次氯酸鹽、季銨鹽、含量1 000 mg/L過氧化氫等對ATP生物熒光法RLU值測定并沒有顯著性影響[18]；但也有文獻報道，乳酸、1 000 mg/L過氧化氫可降低RLU檢測值[19]。因此，加工環境中的消毒劑殘留對清潔度快速檢測是否有影響，需要進一步的研究。