酶比色法測定特殊醫學用途配方食品中的膽堿含量

梁喜玲，盧高超，石旭東，蘭 萌

（1.陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西西安710048；2.陜西西咸新區水務集團有限公司；陜西西安710048）

0 引言

膽堿（Choline）是一種季銨鹽小分子，1849年首次從豬肝中被分離出來，于1862年首次定名，1866年被人工合成出來，化學名稱為β-羥乙基-三甲胺，分子式為C5H15NO2[1]，相對分子質量為121.18，是一種強的有機堿性化合物，熱穩定性相對較好，但在酸性或堿性條件下卻不是很穩定[2]。膽堿及其衍生物廣泛存在于人體中，具有相當重要的生物功能[3]，通常情況下在動物有機體內主要以游離態膽堿、乙酰膽堿、卵磷脂或鞘磷脂等形式存在。膽堿及其衍生物，其本質上是一種水溶性的維生素，在維持正常的人體機能方面有著相當重要的作用，通過大量的試驗探究發現，在大腦的發育及代謝、神經系統信息傳遞、視力的增強及鈣的代謝等功能方面，膽堿均有積極的促進和改善功能[4]。人體一旦缺乏膽堿可能會引起干細胞受損、腎臟損害、記憶力損傷等一系列疾病[5-6]。雖然人體缺乏膽堿會帶來相關疾病，但是過量攝入膽堿的風險也不是很明確，因此膽堿的攝入量只需滿足機體需求即可，無需過量攝入。膽堿是一種重要的營養物質，人體在肝臟中也可以合成膽堿，但人體自然合成的膽堿不足以滿足人類的正常需要，因此從食物中攝取大部分膽堿是很有必要的[7]。人類必須從飲食中獲得一定量的膽堿，尤其是一些特殊的人群，比如孕產婦，除正常的飲食攝取膽堿以外，可以適當補充一些添加了膽堿的特殊營養物質。

膽堿作為食品的營養強化劑，主要的化合物來源有2種，氯化膽堿和酒石酸氫膽堿。GB 5413.20—2013《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定》中的酶比色法做為檢測方法中比較常用的方法，所以建立準確、可靠的檢測方法，可以作為特殊醫學用途配方食品中營養強化劑質量控制的強有力后盾，為保障生命體健康和安全的提供有力技術支撐。目前，對于嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定報道的相對較多，然而對另外一些特殊人群，如孕產婦，其營養補充劑配方食品中膽堿含量的檢測方法報道相對較少。因此，建立快速準確的膽堿類物質檢測方法對于一些特殊配方的食品具有重要意義。

目前，對于膽堿的檢測方法中報道比較多的有酶比色法、雷氏鹽比色法[8-9]、高效液相色譜法[10-13]及毛細管電泳法[14]等。酶比色法為GB 5413.20—2013《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定》[15]中的第一法，是目前檢驗機構主要采用的方法，該方法優點較多，例如專屬性比較強、操作簡便、重復性好、檢出限低、安全性高[16]。試驗擬采用質控樣品、精密度試驗、加標回收試驗和實際樣品測試研究酶比色法用于檢測特殊醫學用途配方食品中（孕產婦營養補充劑）膽堿含量的適用性。

1 試劑與儀器

1.1 樣本與試劑

不同批次的孕產婦營養配方谷粉，2個不同廠家各3批次，總共6個樣本均由企業提供。

膽堿酒石酸氫鹽標準品；磷脂酶D、膽堿氧化酶和過氧化物酶，美國Sigma公司提供，酶的保存需要注意其保存條件；其他常規試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋、ATL-224型電子天平、T9CS型紫外-可見分光光度計等。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本的前處理

樣本的前處理過程完全參照國家標準GB 5413.20—2013《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定》中的方法進行。

1.3.2 標準溶液配制

膽堿氫氧化物標準儲備液（質量濃度2.5 mg/mL）與膽堿氫氧化物標準工作液（質量濃度250 μg/mL）的配制均參照國標方法進行。

1.3.3 發色劑配制

取苯酚50 mg、4-氨基安替比林15 mg、膽堿氧化酶（100~120活力單位）10~15 mg、過氧化物酶（250~280活力單位）1.95~2.35 mg和磷脂酶D（75~100個活力單位）1.80~2.00 mg放置于100 mL容量瓶中，用Tris緩沖溶液（0.05 mol/L）稀釋到刻度線。現用現配。

1.4 加標回收率試驗

在相同的條件下，將質控樣和6個樣本在同樣方法下進行測定，得到其膽堿含量。測定質控樣的膽堿含量后，與該理論值進行比對，對試驗結果的可靠性進行驗證。加標回收試驗：對已測得膽堿含量的樣本，加入一定量的膽堿氫氧化物標準儲備溶液（其質量濃度為2.5 mg/mL）。測定樣本、加標樣品、質控樣和加標質控樣，試驗測定結果進行比對，同時考查加標回收率的情況。

1.5 精密度試驗

1號營養配方食品產前專用產品作為精密度測試試驗的研究對象。分別稱取1號樣本6份，在相同的試驗條件下，平行測定6份產品中的膽堿含量，研究試驗方法的精密度情況。

1.6 數據處理

采用常用軟件Excel軟件進行數據分析處理。

2 步驟分析

2.1 標準曲線的繪制

按照GB 5413.20—2013中的方法，分別移取一定體積的膽堿標準工作溶液（2，4，6，8 mL）用蒸餾水定容于10 mL容量瓶。另準備6支試管，分別做好標記，管A作為試劑空白管，其余5支由1到5編號備用。參照表1中的試劑添加量，加入不同梯度的試劑，然后按照GB 5413.20—2013中的方法進行處理。加入發色劑后，蓋塞密封，混勻，然后將所有試管放置于37℃的恒溫水浴中保溫反應15 min。

標準曲線制備時的試劑添加量見表1。

表1 標準曲線制備時的試劑添加量

15 min反應結束之后，標準溶液的顏色發生明顯的變化。

標準溶液梯度顏色見圖1。

圖1 標準溶液梯度顏色圖

參照國家標準GB 5413.20—2013中膽堿的測定方法，將標準系列溶液用紫外分光光度計進行測定，標準曲線的橫坐標為膽堿標準溶液的質量濃度（μg/mL），縱坐標為相應的吸光度，繪制標準曲線圖，所擬合的標準曲線線性方程為Y=0.003 0X+0.026 5，R2=0.999 7，線性良好，可以采用。

膽堿的標準曲線圖見圖2。

圖2 膽堿的標準曲線圖

2.2 試樣的測定

樣本的測定中，按照表2所示的試劑添加量進行試驗，每個試樣分別準備（B、C）2支試管。

樣本測定時的試劑添加量見表2。

表2 樣本測定時的試劑添加量

在做標準系列溶液的同時，樣本也參照方法同時進行。

3 結果與分析

3.1 樣本測定結果

取質控樣品和6個不同批次的樣本5 g，同一種樣品均取平行樣，分別測定膽堿含量。該方法的檢出限為1 mg/100 g，定量限為3 mg/100 g。

質控樣和6個樣本的膽堿含量見表3。

表3 質控樣和6個樣本的膽堿含量

3.2 加標回收驗證試驗結果

加標回收率試驗見表4。

表4 加標回收率試驗

在表4中，前6組數據是1號樣本的加標回收試驗，最后一組是質控樣本（樣品質量為2.501 6 g）的加標回收試驗。由表4可知，特殊醫學用途配方食品樣本和質控樣的加標回收率均較高，樣本的回收率結果為93.2%~96.6%，質控樣為95.00%，相對標準偏差為0.82%，值相對較小，由加標回收率試驗結果可以看出，酶比色法適合檢測特殊醫學用途配方食品中的膽堿含量，由上述可說明該方法可靠性高，具有較好的準確度。

3.3 精密度試驗結果

1號樣本精密度試驗結果見表5。

表5 1號樣本精密度試驗結果

由表5可知，對1號樣本測定6次平行試驗的結果進行分析，膽堿含量平均值為126.35 mg/100 g，相對標準偏差為1.15%，表明該方法的精密度較好，可以滿足檢測要求。

4 結論

研究中嬰幼兒配方粉質控樣膽堿含量理論值與測定值在允許誤差范圍內，證明測定結果具有可靠性；質控樣和1號樣本的加標回收率為93.2%~96.6%，相對標準偏差為1.15%，證明GB 5413.20—2013中的酶比色法準確度較高，精密度較好，測定結果準確、可信。并且該6批次市售的特殊醫學用途配方食品中膽堿含量均符合該企業標準中對膽堿含量添加量的要求，表明酶比色法適合檢測特殊醫學用途配方食品中的膽堿含量，具有實際參考價值。