雙酶法提取大蒜水溶性膳食纖維及其抗氧化活性分析

張 云，苗敬芝，2，董玉瑋，2，李 勇，2，鄧錦慧，羅 姣

（1.徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇徐州221018；2.江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州221018）

0 引言

大蒜為百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，是一種藥食同源的蔬菜[1]。大蒜含有多種生物活性物質，主要有氨基酸、膳食纖維、大蒜素、黃酮類、維生素、微量元素等，具有抗菌消炎、抗氧化防衰老、清除體內自由基、增強機體免疫力等生理功能[2-4]。膳食纖維根據其溶解性不同，分為水溶性膳食纖維（SDF）和水不溶性膳食纖維（IDF）兩大類。研究表明，水溶性膳食纖維對人體有多種生理功效，如增強腸道益生菌群、防癌抗癌、降血糖、降血脂、預防糖尿病等[5-7]。

試驗采用雙酶法提取大蒜水溶性膳食纖維，利用酶的專一性、高效性、反應條件溫和等優勢，縮短提取時間、提高提取效率[8]，通過單因素試驗和正交試驗優化大蒜水溶性膳食纖維的提取工藝條件，并對其抗氧化活性進行研究，為大蒜的綜合開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜，購于徐州華聯超市；纖維素酶（50 000 U/g）、木瓜蛋白酶（50 000 U/g），江蘇銳陽生物科技有限公司提供；抗壞血酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、DPPH、鄰苯三酚、95%乙醇等，均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

DHG-9075A型電熱鼓風干燥箱，上海慧泰儀器制造有限公司產品；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產品；723G型可見分光光度計，上海分析儀器有限公司產品；TDL-6型低速大容量離心機，金壇晨陽電子儀器廠產品；SENCO型旋轉蒸發儀，上海申生科技有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 大蒜SDF提取工藝流程

大蒜→去皮、清洗→切片、護色（0.5%抗壞血酸）→烘干、粉碎，過篩→稱取樣品→按一定料液比加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液→加纖維素酶和木瓜蛋白酶→酶解→滅酶→過濾，取濾液，加入4倍體積95%乙醇醇沉→過濾、濾渣干燥，稱質量→成品。

1.3.2 單因素試驗

設置纖維素酶加酶量、木瓜蛋白酶加酶量、酶解時間、酶解溫度4個因素進行單因素試驗。

大蒜SDF提取單因素試驗見表1。

表1 大蒜SDF提取單因素試驗

1.3.3 正交試驗設計

基于單因素試驗結果，考查纖維素酶加酶量、木瓜蛋白酶加酶量、酶解時間、酶解溫度對大蒜SDF得率的影響。

正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設計

1.3.4 大蒜SDF抗氧化活性分析

（1）對O2-自由基清除率的測定[9]。分別取不同質量濃度大蒜SDF各2.00 mL，依次加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH值8.2）4.0 mL置于試管中，于25℃下水浴20 min，加2.5 mmol/L鄰苯三酚溶液2 mL，充分混勻，于25℃下反應5 min，加8%的鹽酸溶液2 mL終止反應。以蒸餾水作空白試驗，于波長325 nm處測定吸光度。計算不同質量濃度的大蒜SDF對O2-自由基的清除率。

式中：A1——樣品的吸光度；

A0——空白品的吸光度。

（2）對DPPH自由基清除率的測定[10]。分別取不同質量濃度大蒜SDF各2.00 mL，依次加入0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，于25℃下反應25 min，于波長517 nm處測定吸光度。以蒸餾水作空白試驗，以相同質量濃度的維C溶液作對比，計算不同質量濃度大蒜SDF對DPPH的清除率。

式中：A1——樣品的吸光度；

A0——空白品的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗條件選擇

2.1.1 纖維素酶加酶量纖維素酶加酶量對大蒜SDF得率的影響見圖1。由圖1可知，隨著纖維素酶加酶量的增加，大蒜SDF得率先增后降，1.6%時得率最高為29.5%。在一定質量濃度范圍內，隨著酶質量濃度增加，酶與底物接觸幾率增加，酶與底物質量濃度最合適時，有利于水溶性膳食纖維的釋放，酶質量濃度過高，底物質量濃度不足，酶解效率降低[11]。因此，纖維素酶最適加酶量為1.6%。

圖1 纖維素酶加酶量對大蒜SDF得率的影響

2.1.2 木瓜蛋白酶加酶量

由圖2可知，隨著木瓜蛋白酶加酶量的增加，大蒜SDF得率上升，2.2%時得率最高為28.8%，之后呈下降趨勢。因此，木瓜蛋白酶最適加酶量為2.2%。

圖2 木瓜蛋白酶加酶量對大蒜SDF得率的影響

2.1.3 酶解時間

酶解時間對大蒜SDF得率的影響見圖3。

由圖3可知，隨著酶解時間增加，大蒜SDF得率上升，180 min時達到最高為30.50%，之后呈下降趨勢，可能隨著時間延長，大蒜SDF部分降解。因此，最適酶解時間為180 min。

圖3 酶解時間對大蒜SDF得率的影響

2.1.4 酶解溫度

酶解溫度對大蒜SDF得率的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對大蒜SDF得率的影響

由圖4可知，隨著酶解溫度升高大蒜SDF得率上升，溫度50℃時達到最高為30.60%，之后下降。溫度升高，分子運動加快，使溶質快速溶出，大蒜SDF得率提高，溫度過高，酶分子的空間結構發生改變，酶活性降低，影響酶促反應的進行，大蒜SDF得率下降[12]。因此，最適酶解溫度為50℃。

2.2 正交試驗優化大蒜SDF提取工藝條件

大蒜SDF提取正交試驗結果見表3。

表3 大蒜SDF提取正交試驗結果

由表3可知，各單因素對大蒜SDF得率的影響大小順序為B>A>D>C，即木瓜蛋白酶加酶量>纖維素酶加酶量>酶解溫度>酶解時間。大蒜SDF最佳提取工藝條件是A3B2C2D3，即纖維素酶加酶量2.2%，木瓜蛋白酶加酶量2.2%，酶解時間180 min，酶解溫度55℃。在此條件下進行3次驗證試驗，取其平均值大蒜SDF得率為32.06%。

2.3 大蒜SDF抗氧化活性分析結果

2.3.1 大蒜SDF對O2-自由基的清除效果

大蒜SDF對O2-自由基的清除效果見圖5。

圖5 大蒜SDF對O2-自由基的清除效果

由圖5可知，隨著大蒜SDF質量濃度的增加對O2-自由基的清除率增大，當大蒜SDF質量濃度0.7 mg/mL時，清除率80.01%，清除效果明顯，之后清除率變化緩慢。

2.3.2 大蒜SDF對DPPH自由基的清除效果

大蒜SDF對DPPH自由基的清除效果見圖6。

圖6 大蒜SDF對DPPH自由基的清除效果

由圖6可知，隨著大蒜SDF質量濃度的增加對DPPH自由基的清除率增大，當大蒜質量濃度0.7 mg/mL時，清除率80.15%，之后清除率變化緩慢，說明大蒜SDF對DPPH自由基具有較強的清除能力。

3 結論

（1）通過單因素試驗和正交試驗優化大蒜SDF提取的工藝條件，各因素對大蒜SDF得率的影響大小順序為B>A>D>C，即木瓜蛋白酶加酶量>纖維素酶加酶量>酶解溫度>酶解時間；大蒜SDF最佳提取工藝條件是A3B2C2D3，即纖維素酶加酶量2.2%，木瓜蛋白酶加酶量2.2%，酶解時間180 min，酶解溫度55℃，大蒜SDF得率為32.06%。

（2）大蒜SDF對O2-自由基和DPPH自由基均表現出較強的清除能力，且隨著質量濃度的增加清除率增大，呈明顯的量效關系。表明它是一種優質的食物纖維，可作為一種天然綠色的食品添加劑，添加到乳制品、焙烤制品、飲料等產品中，具有良好的應用前景。