銀杏紅曲維生素組方調脂有效性與安全性研究

劉瑩?彭隆?胡成

【摘要】目的 探討銀杏紅曲維生素組方（MGM）對混合型高脂血癥大鼠血脂水平的影響及其急性毒性。方法 采用混合型高脂血癥SD大鼠模型，灌胃給予25 mg/kg、50 mg/kg劑量的MGM和陽性對照品32 d后，評價MGM的調脂效果。采用最大耐受劑量法評價23.2 g/（kg·d）的MGM單次給藥72 h后對BALB/c小鼠與SD大鼠2種嚙齒類動物的急性毒性。結果 MGM及陽性對照品給藥32 d后較給藥前顯著降低高脂血癥大鼠總膽固醇、甘油三酯和LDL-C的含量（P均< 0.001），其中25 mg/kg的MGM的調脂效果與50 mg/kg劑量的陽性對照品相當，表明MGM的復方優于陽性對照品的調脂效果。急性毒性實驗結果顯示MGM對大、小鼠的最大耐受劑量為23.2 g/（kg·d），相當于人體推薦口服劑量的1933倍，在該劑量下觀察小鼠與大鼠心臟、肝臟、腎臟的病理切片結果未發現損傷性病變。結論 MGM顯著降低高脂血癥大鼠的血脂水平，在推薦量范圍內服用MGM安全可靠。

【關鍵詞】銀杏葉提取物;紅曲提取物;葉酸;維生素B6;急性毒性

Hypolipidemic efficacy and safety of Ginkgo biloba leaf and Monascus extracts combined with vitamin mixture Liu Ying， Peng Long， Hu Cheng. Department of Infectious Disease， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China Corresponding author， Hu Cheng， E-mail： hucheng2@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To evaluate the hypolipidemic efficacy and acute toxicity of Ginkgo biloba leaf and Monascus extracts combined with folic acid and vitamin B6 （MGM） in SD rats with mixed hyperlipidemia. Methods The SD rat models with mixed hyperlipidemia were orally given with 25 mg/kg， 50 mg/kg of MGM and positive control substance for 32 d to explore the efficacy of MGM on the blood lipid level. The acute toxicity at 72 d after single administration of 23.2 g/（kg·d） MGM in BALB/c mice and SD rats was assessed by the maximum tolerated dose method. Results In the MGM and positive control substance groups， the contents of total cholesterol （TC）， triglycerides （TG） and low density lipoprotein-cholesterol （LDL-C） at 32 d after administration were significantly lower compared with those before administration （all P < 0.001）， and the lipid-lowering effect of MGM at a dose of 25 mg/kg was equivalent to that of the positive control substance at 50 mg/kg. Acute toxicity test showed that the maximum tolerated dose of MGM for the rats and mice was 23.2 g/（kg·d）， 1933 times of the recommended human oral dose. After administration at this dose， no pathological changes were observed in the tissues sections of heart， liver and kidney. Conclusion MGM can significantly reduce the blood lipid level in rat models with mixed hyperlipidemia， which is safe and reliable when administered within the recommended range of dose.

【Key words】Ginkgo biloba leaf extract;Monascus extract;Folic acid;Vitamin B6;Acute toxicity

血脂異常升高是導致心腦血管疾病發生的主要元兇。在伴有高血壓、年齡超過40歲、糖尿病等危險因素存在的情況下，血脂的正常值需向下作顯著的調整，以降低共患病風險而防止心腦血管疾病的發生[1]。2019年一項中國人群隊列研究結果顯示HDL-C < 1.3 mmol/L時缺血性和出血性腦卒中發病風險均明顯增加。因此，控制血脂對健康狀況的維持亞健康的預防和疾病狀態的治療具有十分重要的意義。近30年來，中國人群的血脂水平逐步升高，血脂異常患病率明顯增加。據統計2012年中國成人血脂異常總體患病率高達40.4%，血清膽固醇水平的升高將導致2010至2030年我國心血管病事件約增加920萬[2]。血脂異常的主要危害是增加動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）及慢性腎臟病并發動脈粥樣硬化相關性心臟病的發病危險，是威脅我國人民身體健康的重要危險因素[3]。

高脂血癥治療常用他汀類藥物，但其不良反應也不容忽視，比如肝損、肌溶解、血糖升高、停藥后快速反彈[4]。這些不良反應阻礙了部分患者使用他汀類藥物的依從性，同時也讓血脂升高的亞健康人群將其拒之門外。因此，研發天然全植物成分或藥食同源配方的調脂保健產品具有巨大的社會需求。本研究探討了一種藥食同源銀杏紅曲維生素組方（MGM）對混合型高脂血癥大鼠調脂的有效性，同時在正常大、小鼠上進行急性毒性實驗觀察其安全性。

材料與方法

一、試劑

MGM由銀杏葉提取物、紅曲提取物、葉酸和維生素B6的混合物經制粒、過篩為棕紅色粉末狀，使用時用無菌水配置，由廣州市賽普特醫藥科技股份有限公司提供。陽性對照品是依據南京海陵中藥制藥工藝技術研究有限公司申請的《預防或治療心腦血管疾病的紅曲、銀杏葉組合物及其應用（專利號：CN200510041265.7）》發明專利組方而設定，以銀杏葉提取物和紅曲粉碎后過60目篩后按1∶1的質量比混合而成。銀杏葉提取物購自浙江康恩貝制藥股份有限公司;紅曲提取物購自杭州雙馬球生物股份有限公司;葉酸、維生素B6購自江西天新藥業股份有限公司。

總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL-C、HDL-C試劑盒均購自上海科華生物工程股份有限公司;中性樹膠（中國上海標本模型廠），HE染色液（無錫市江原實業技貿總公司）。

二、儀器

BS-3000A電子分析天平（上海友聲衡器有限公司），5418臺式高速離心機（德國EPPENDORF），7020型全自動生化儀（日本株式會社日立高新技術），JJ2000電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），BSA224S電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。ECLIPSE Ci-S正置顯微鏡（尼康公司），DHG-9145A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

三、MGM對混合型高脂血癥大鼠調脂功效評價方法

健康雄性SPF級SD大鼠50只，體質量220.3 ～ 261.9 g，購自廣東省醫學實驗動物中心。

第1次分組：大鼠檢疫期結束后，按照動物體質量隨機分為正常對照組10只，高脂飼料（HFC）模型組（模型組） 40只。 正常對照組給予維持飼料，模型組給予HFC，持續2周（給藥前）。HFC是在維持飼料中添加20.0%蔗糖、15.0%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，適量的酪蛋白、磷酸氫鈣和石粉等。所有飼料均由廣東省醫學實驗動物中心提供。

第2次分組：HFC喂養2周后，動物不禁食，使用異氟烷吸入麻醉后，眼眶靜脈竇采血，3000 轉/分離心10 min，分離血清，使用7020型全自動生化分析儀測定血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量。模型組淘汰血清TC含量較低的10只動物，根據動物血清TC水平將模型組剩余動物隨機分為3組。MGM的人體推薦口服劑量為0.012 g/（kg·d），實驗設約人體推薦劑量的2倍和4倍為MGM的劑量，即分別為25 mg/kg和50 mg/kg劑量的MGM組及陽性對照組（50 mg/kg），每組10只大鼠。正常對照組大鼠按體質量灌胃給予純凈水，各給藥組分別給予對應的藥物溶液，每日給藥1次，連續給藥32 d，給藥32 d后采血分離血清，測定血脂含量。

四、MGM急性毒性實驗安全性評價方法

健康SPF級BALB/c小鼠，體質量19 ～ 22 g，40只;SD大鼠，體質量220.3 ～ 261.9 g，10只，雌雄各半;購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，動物自由進食飲水。

參照《GB15193.3-2014食品安全國家標準：急性經口毒性試驗》的最大耐受劑量法進行本配方的安全性評價。將40只正常的BALB/c小鼠隨機分成正常組20只，MGM組20只;10只正常SD大鼠隨機分成正常組4只，MGM組6只。

動物隔夜禁食后灌胃給予MGM溶液，1 d給藥2次，間隔4 h，總給藥劑量為23.2 g/（kg·d）是人體推薦口服劑量的1933倍。給藥前后動物稱重，72 h內觀察記錄動物死亡情況及中毒表現等;72 h時各組動物取心臟、肝臟和腎臟稱量各臟器濕重，計算臟器系數 （%） = 臟器濕重/體質量×100%，然后將各臟器放入固定液中固定后進行石蠟包埋及HE染色進行各臟器組織病理學檢查。

五、統計學處理

應用Graphpad Prism 7.0軟件對數據進行統計和作圖。正態分布定量資料用表示，2組間若方差齊性則采用獨立樣本t檢驗，若方差不齊則采用Welchs校正t檢驗;不服從正態分布的定量資料以M（P25， P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗。各組給藥前后比較，2組數據的差值服從正態分布，采用配對t檢驗;不服從正態分布采用Wilcoxon符號秩和檢驗。α = 0.05。

結果

一、MGM對混合型高脂血癥大鼠調脂功效評價

模型組大鼠喂養HFC 2周后，與正常對照組比較，血清HDL-C的含量變化不顯著，表明HFC喂養對大鼠HDL-C的水平無影響;模型組大鼠血清總TC、TG和LDL-C的含量升高（P均< 0.001），表明高脂血癥大鼠模型建立成功，見表1。

正常對照組在0 d和32 d檢測血清中的TC、TG和LDL-C含量未見顯著變化。

25 mg/kg劑量MGM給藥32 d后TC含量[（3.873 ±0.681）mmol/L]較給藥前[（5.951±0.828）mmol/L]降低（P < 0.001）;50 mg/kg劑量MGM給藥32 d后TC含量[（3.959±0.924）mmol/L]較給藥前[（5.997 ±1.048）mmol/L]降低（P < 0.001）;陽性對照品給藥32 d后TC含量[4.046 （3.010， 4.818）mmol/L]較給藥前[6.035 （5.373， 6.775）mmol/L]降低（P = 0.004）。25 mg/kg劑量MGM給藥32 d后TG含量[（1.263 ±0.416）mmol/L]較給藥前[（3.951±1.015）mmol/L]降低（P < 0.001）;50 mg/kg劑量MGM給藥32 d后TG含量[（1.417±0.691）mmol/L]較給藥前[（4.311±1.714）mmol/L]降低（P < 0.001）;陽性對照品給藥32 d后TG含量[（1.427±0.400）mol/L]較給藥前[（3.379±0.908）mol/L]降低（P < 0.001）。

LDL-C含量25 mg/kg劑量MGM給藥32 d后LDL-C含量[（0.479±0.079）mol/L]較給藥前[（1.096±0.167）mol/L]降低（P < 0.001）;50 mg/kg劑量MGM給藥32 d后LDL-C為[（0.565±0.219）mol/L]較給藥前[（1.314±0.492）mol/L]降低（P < 0.001）;陽性對照品給藥32 d后LDL-C含量[（0.514±0.125）mol/L]較給藥前[（1.108±0.277）mol/L]降低（P < 0.001）。25 mg/kg的MGM的調脂效果與50 mg/kg劑量的陽性對照品相當，表明MGM的復方優于陽性對照品的調脂效果。

動物灌胃各試劑32 d后，正常對照組、MGM（25和50 mg/kg）組及陽性對照組大鼠血清中HDL-C的含量變化不顯著，各組HDL-C含量分別為（0.534±0.081）mol/L、（0.633±0.117）mol/L、0.625（0.535，0.658） mol/L、（0.611±0.052）mol/L，說明HFC不會造成大鼠HDL-C水平的紊亂。

二、MGM急性毒性實驗安全性評價

1.一般臨床觀察及體質量

急性毒性實驗在2次灌胃后的72 h內各組均無動物死亡，大、小鼠行為活動均正常，無明顯中毒反應。72 h動物解剖肉眼觀察心、肝、腎等主要器官未見顏色形態異常，亦沒有出血點或其他病理改變。給藥前大、小鼠2組體質量比較差異無統計學意義（P > 0.05），說明隨機分組均勻。23.2 g/kg的MGM給藥后，2組體質量及各臟器系數比較差異均無統計學意義（P均> 0.05），見表2 ～ 4。急性毒性實驗結果表明MGM對大、小鼠的最大耐受量為23.2 g/（kg·d），相當于人體推薦口服劑量的1933倍，未能測出LD50。按照急性毒性劑量分級，屬無毒級。

2.組織病理學檢查

2組的心臟、肝臟、腎臟等主要器官肉眼觀察未見顏色形態異常，亦沒有出血點或其他病理改變。HE染色結果顯示與正常組比較，MGM急性給藥未見小鼠和大鼠心臟、肝臟、腎臟主要臟器發生病理性損傷，各臟器結構清晰、細胞形態正常，初步數據表明MGM在高出人體推薦劑量1933倍的基礎上是安全的，見圖1。

討論

高脂血癥是一種慢性疾病，治療周期長，患者需長期服藥，然而長時間服用他汀類藥物容易產生耐藥性和不良反應。藥食同源材料的復方毒性極低、適合長期服用。

紅曲為傳統發酵產品，紅曲提取物是從紅曲總體去分離得到以洛伐他汀為標準的產品，它是膽固醇合成限速酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，其對高脂血癥具有較好的預防和治療效果，并具有抗動脈粥樣斑塊形成作用，紅曲劑量與藥效呈正相關[5]。銀杏提取物中含有銀杏總黃酮、銀杏內酯等物質并主要以苷的形式存在。有研究發現銀杏提取物能夠通過調節高脂血癥大鼠的多不飽和脂肪酸的分布、抑制HMG-CoA還原酶，促進糞便膽固醇的增加，進而導致膽固醇的吸收減少，以及血漿和肝膽固醇的降低，發揮調脂的作用[6]。南京海陵中藥制藥工藝技術研究有限公司申請的《預防或治療心腦血管疾病的紅曲、銀杏葉組合物及其應用》發明專利證實紅曲提取物與銀杏葉提取物按1∶1配比關系配制，具有顯著的協同作用。本研究所用配方是在銀杏葉和紅曲提取物組分的基礎上進一步添加了葉酸與維生素B6，觀察其與脂質代謝之間的聯系。

本研究結果顯示，MGM給藥32 d后顯著降低大鼠血清中TC、TG和LDL-C的水平，具有調脂作用，且MGM復方優于陽性對照品的調脂效果，證實MGM四組分的配方比紅曲和銀杏葉兩組分配方具有更強的協同調脂作用。為了保證銀杏葉、紅曲提取物合并葉酸與維生素B6聯用復方做為調脂產品的安全性，初步急性毒性實驗，正常雌雄大、小鼠MGM的最大耐受劑量為23.2 g/（kg·d），高于人體推薦劑量的1933倍，病理組織學檢查MGM組動物心臟、肝臟和腎臟未見異常改變。按照急性毒性劑量分級，屬無毒級，說明按推薦量食用是安全的。根據以上結果，我們可以初步判斷，在人體推薦劑量范圍內服用MGM是有效、安全的。

參考文獻

[1] 中國成人血脂異常防治指南修訂聯合委員會. 中國成人血脂異常防治指南 （2016年修訂版）. 中國循環雜志，2016，31 （10）： 937-953.

[2] Moran A， Gu D， Zhao D， Coxson P， Wang YC， Chen CS， Liu J， Cheng J， Bibbins-Domingo K， Shen YM， He J， Goldman L. Future cardiovascular disease in china： markov model and risk factor scenario projections from the coronary heart disease policy model-china. Circ Cardiovasc Qual Outcomes，2010，3（3）：243-252.

[3] 胡文濤， 李少敏， 劉佩佳， Desmond Y.H.Yap， 劉迅. 血脂水平在不同CKD分期患者中與心血管事件和全因死亡預后關系研究. 新醫學，2020，51（6）： 439-444.

[4] Baigent C， Keech A， Kearney PM， Blackwell L， Buck G， Pollicino C， Kirby A， Sourjina T， Peto R， Collins R， Simes R; Cholesterol Treatment Trialists' （CTT） Collaborators. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment： prospective meta-analysis of data from 90，056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet，2005，366（9493）：1267-1278.

[5] Alberts AW， Chen J， Kuron G， Hunt V， Huff J， Hoffman C， Rothrock J， Lopez M， Joshua H， Harris E， Patchett A， Monaghan R， Currie S， Stapley E， Albers-Schonberg G， Hensens O， Hirshfield J， Hoogsteen K， Liesch J， Springer J. Mevinolin： a highly potent competitive inhibitor of hydroxymethylglutaryl-coenzyme a reductase and a cholesterol-lowering agent. Proc Natl Acad Sci U S A，1980，77（7）：3957-3961.

[6] Zhang Q， Wang GJ， A JY， Wu D， Zhu LL， Ma B， Du Y. Application of GC/MS-based metabonomic profiling in studying the lipid-regulating effects of Ginkgo biloba extract on diet-induced hyperlipidemia in rats. Acta Pharmacol Sin，2009，30（12）：1674-1687.

（收稿日期：2021-01-05）

（本文編輯：楊江瑜）