骨碎補(bǔ)總黃酮基于Notch信號(hào)通路改善骨質(zhì)疏松的作用及機(jī)制

黃翔宇 林立垚 郝敏 劉凱

(1麗水學(xué)院，浙江 麗水 323000；2麗水市第二人民醫(yī)院)

骨質(zhì)疏松常表現(xiàn)為原發(fā)性類型，其特征為骨量減少、骨強(qiáng)度下降等骨組織顯微結(jié)構(gòu)變化，致使患者骨脆性增加，進(jìn)而引發(fā)骨折等臨床表現(xiàn)〔1〕。骨質(zhì)疏松患者最常表現(xiàn)為腰背部的疼痛，進(jìn)而可致全身骨骼疼痛或髖、膝及腕關(guān)節(jié)，對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響〔2，3〕。骨碎補(bǔ)作為中醫(yī)骨科常用的中藥品種之一，具有活血續(xù)傷、補(bǔ)腎強(qiáng)骨的功效，且現(xiàn)代藥理研究表明，其主要成分總黃酮(DMF)能夠有效作用于骨質(zhì)疏松患者，可維持其骨微結(jié)構(gòu)的完整程度，并提升骨密度〔4〕。現(xiàn)階段關(guān)于DMF對(duì)于骨質(zhì)疏松患者的作用機(jī)制尚不明確，可能作用于Notch信號(hào)通路中，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的連鎖反應(yīng)。本文旨在研究DMF對(duì)于骨質(zhì)疏松的作用效果及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 胎牛血清(以色列Biological Industries公司)、DMEM高糖培養(yǎng)液、DMEM/F12培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國(guó)Hyclone)、Ⅰ型膠原酶(美國(guó)Invitrogen公司)、紅細(xì)胞裂解液(中國(guó)Solarbio公司)、Notch-1一抗、Hes-1一抗、GAPDH一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)、Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增試劑盒(日本TaKaRa Bio公司)、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1試劑盒、白細(xì)胞介素(IL)-6試劑盒(上海中喬新舟公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天公司)及水合氯醛(成都科龍化工公司)。

1.2儀器 高速冷凍離心機(jī)(上海安亭公司，型號(hào)TGL-16G-A)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Bio公司，型號(hào)7300)、電子天平(上海特勒托多利多公司，型號(hào)EL204)、酶標(biāo)儀(德國(guó)Thermo公司)、電泳儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)、凝膠成像儀(美國(guó)Bio Rad提供)。

1.3藥品 強(qiáng)骨膠囊(北京岐黃醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030007，主要成分為DMF，規(guī)格0.25 g/s)。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠63只，雌性，均正常發(fā)育，6～8月齡，體重160～200 g。

1.5方法

1.5.1制備含藥血清 大鼠均予以強(qiáng)骨膠囊進(jìn)行灌胃，劑量為1 800 mg/kg，每日2次，持續(xù)3 d，后參照文獻(xiàn)〔5〕進(jìn)行含藥血清制備。研究共分為7組是體外實(shí)驗(yàn)研究，分離培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，以不同配比給藥方式探討總黃酮改善骨質(zhì)疏松是否與Noch信號(hào)通路有關(guān)。

1.5.2分離并鑒定骨髓基質(zhì)細(xì)胞 將1月齡的大鼠脛骨與股骨取出，并參照文獻(xiàn)〔6〕分離并鑒定其骨髓基質(zhì)細(xì)胞。

1.5.3RT-PCR檢測(cè)Notch-1、Hes-1 mRNA水平〔7〕以維A酸(RA)誘導(dǎo)建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，并取1.5.2對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，將其接種至6孔板內(nèi)，接種濃度為5×103/ml，并對(duì)每組大鼠設(shè)置復(fù)孔，復(fù)孔數(shù)目為3個(gè)；以10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃，并含5%CO2，貼壁培養(yǎng)24 h；NC組骨髓基質(zhì)細(xì)胞予以含10胎牛血清的DEME高糖完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；RA組骨髓基質(zhì)細(xì)胞予以濃度為0.4 mmol/L的RA進(jìn)行培養(yǎng)；DMF聯(lián)合RA組骨髓基質(zhì)細(xì)胞予以含DMF血清的DEME高糖完全培養(yǎng)液及濃度為0.4 mmol/L的RA進(jìn)行培養(yǎng)；Jagged Ⅰ蛋白聯(lián)合RA組骨髓基質(zhì)細(xì)胞予以濃度為1 000 μg/L的Jagged Ⅰ及濃度為0.4 mmol/L的RA進(jìn)行培養(yǎng)；Jagged Ⅰ蛋白聯(lián)合DMF及RA組骨髓基質(zhì)細(xì)胞予以濃度為1 000 μg/L的Jagged Ⅰ、含DMF血清的DEME高糖完全培養(yǎng)液及濃度為0.4 mmol/L的RA進(jìn)行培養(yǎng)；γ-分泌酶抑制劑(DAPT)聯(lián)合RA組骨髓基質(zhì)細(xì)胞予以濃度為16 μmol/L的DAPT及濃度為0.4 mmol/L的RA進(jìn)行培養(yǎng)；DAPT聯(lián)合DMF及RA組骨髓基質(zhì)細(xì)胞予以濃度為16 μmol/L的DAPT、含DMF血清的DEME高糖完全培養(yǎng)液及濃度為0.4 mmol/L的RA進(jìn)行培養(yǎng)；以Trizol試劑盒對(duì)以上各組骨髓基質(zhì)細(xì)胞總DNA予以提取，以核酸測(cè)定儀對(duì)各組RNA純度及濃度予以測(cè)定；各組均取1 μg骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA，以SYBR green染料法對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增〔8，9〕，Notch-1：正向引物5′-CTCCCCGTTCCAGCAGTCTC-3′，反向引物5′-CAGCCACTCGCATTGACCAT-3′；Hes-1：正向引物5′-AGGCGGCTAAGGTGTTGGAGG-3′，反向引物5′-GGCCGCTGGAAGGTGACACTG-3′；GAPDH：正向引物5′ACCCATCACCATCTTCCAGGAG-3′，反向引物5′-GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3′。

1.5.4Western印跡檢測(cè)Notch-1、Hes-1水平〔10〕按1.5.1細(xì)胞培養(yǎng)及給藥方法進(jìn)行制備，提取細(xì)胞內(nèi)的組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并進(jìn)行凝膠電泳，進(jìn)樣量為20 μg，將其電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，以3%脫脂奶將其封閉2 h，于4℃下孵育Notch-1及Hes-1一抗與GAPDH一抗過(guò)夜，以TBST洗膜，且在二抗孵育后明顯顯影；以Quantityone軟件分析條帶亮度。

1.5.5免疫組化法檢測(cè)Notch-1、Hes-1水平〔11〕以常規(guī)法制備5 μm石蠟切片，并對(duì)其進(jìn)行免疫組化染色，以濃度為10 mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液對(duì)其進(jìn)行熱激，時(shí)長(zhǎng)30 min，刺激其抗原復(fù)性，于4℃下孵育Notch-1及Hes-1一抗與GAPDH一抗過(guò)夜，以TBST洗膜，孵育二抗后向其中加入顯色液予以曝光，結(jié)合其染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

Jagged Ⅰ聯(lián)合RA組Notch-1、Hes-1 mRNA、蛋白水平顯著高于RA組(P<0.05)，DMF聯(lián)合RA組及DAPT聯(lián)合RA組Notch-1、Hes-1 mRNA、蛋白水平顯著低于RA組(P<0.05)；Jagged Ⅰ聯(lián)合DMF及RA組Notch-1、Hes-1 mRNA、蛋白水平顯著低于JaggedⅠ聯(lián)合RA組(P<0.05)；DAPT聯(lián)合DMF及RA組Notch-1、Hes-1 mRNA、蛋白水平顯著低于DAPT聯(lián)合RA組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組骨髓基質(zhì)細(xì)胞Notch-1、Hes-1 mRNA、蛋白水平

3 討 論

骨質(zhì)疏松作為老年患者常見(jiàn)的骨科疾病，其本質(zhì)為患者骨密度與骨質(zhì)量的下降所致骨微結(jié)構(gòu)受損，徒增其骨脆性，進(jìn)而具有較高概率引發(fā)全身性骨病〔12〕。現(xiàn)階段臨床上通常將骨質(zhì)疏松分為兩類，即繼發(fā)性與原發(fā)性，而原發(fā)性骨質(zhì)疏松是目前常見(jiàn)的類型，多出現(xiàn)于老年患者。骨質(zhì)疏松具有高發(fā)病率，對(duì)于患者的日常生命活動(dòng)具有極大影響。而相關(guān)研究表明，Notch信號(hào)通路對(duì)于疾病的發(fā)生及發(fā)展具有直接關(guān)聯(lián)，可調(diào)控細(xì)胞的多種進(jìn)程〔13〕。Notch具有多種受體，常見(jiàn)的為Notch-1、Notch-2、Notch-3及Notch-4，當(dāng)受體與配體進(jìn)行特異性結(jié)合后，Notch信號(hào)通路則因此被激活，并向其激活下游靶基因Hes進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。其中Hes-1作為Notch信號(hào)通路下常見(jiàn)的Hes基因，同樣因轉(zhuǎn)錄而被激活〔14〕。現(xiàn)階段，與Notch信號(hào)通路相關(guān)的各信號(hào)分子、受體及下游靶基因Hes等在骨質(zhì)疏松患者中的表達(dá)機(jī)制尚不明確。研究表明，DMF能夠促進(jìn)新骨形成，同時(shí)抑制骨的吸收，增加患者的骨密度，且DMF作為中藥材骨碎補(bǔ)的有效成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，DMF能夠有效針對(duì)化學(xué)刺激及熱傳導(dǎo)所引發(fā)的擬痛反應(yīng)，且具有明顯的量效相關(guān)性〔15〕。本研究結(jié)果說(shuō)明DMF對(duì)于骨質(zhì)疏松具有明顯的改善效果，且其作用機(jī)制大致與Notch信號(hào)通路相關(guān)。