蔥白提取物對(duì)癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶及細(xì)胞凋亡的影響

邵延萱 李晶 薛晴 羅文哲

(佳木斯大學(xué) 1臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007； 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3研究生院)

神經(jīng)細(xì)胞異常放電可造成常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病癲癇發(fā)生，在生物電發(fā)生改變的同時(shí)會(huì)有一些氧自由基或過(guò)氧化物大量產(chǎn)生而破壞神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡，因此，神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡是癲癇發(fā)病的重要機(jī)制之一。而探索癲癇神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制也常集中在最敏感的腦區(qū)，即皮質(zhì)和海馬部位。蔥白提取物的主要成分有多糖、黃酮、脂肪酸及甾體類(lèi)化合物等，具有抗癌、心血管保護(hù)等療效。目前，未見(jiàn)報(bào)道蔥白提取物對(duì)癲癇模型大鼠腦電圖(EEG)、學(xué)習(xí)記憶能力、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3和抗凋亡因子(Livin)的影響；本文對(duì)以上影響進(jìn)行分析，并探討蔥白提取物的神經(jīng)保護(hù)效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)環(huán)境 選取購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的30只6周齡雄性健壯SD大鼠(初始體重180～200 g)，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黑) 2015-001。經(jīng)佳木斯大學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開(kāi)始造模型。

1.2主要試劑與儀器 蔥白提取物購(gòu)于武漢市第一醫(yī)院；Y迷宮(張家港市三興教學(xué)儀器廠)；BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)及BL-420N生物信號(hào)采集系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；美國(guó)Sigma公司的戊四氮(PTZ)；A型電子精密天平(上海衡平科學(xué)儀器有限公司)；鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)及枸櫞酸鈉緩沖液、多聚賴(lài)氨酸、第一抗兔抗人Livin多克隆抗體、Caspase-3多克隆抗體均購(gòu)于武漢博士德公司；電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝科技研究所)； TGL-168高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；醫(yī)用超低溫冰箱(日本三洋電器有限公司)；立體定位儀(日本島津)；4%多聚甲醛。

1.3制造模型方法和分組 30只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、治療組各10只。各組處理方式：模型組與治療組都用PTZ腹腔注射(用雙蒸水配成10 g/L 溶液，按35 mg/kg給藥)，正常組用相同劑量的生理鹽水腹腔注射。治療組蔥白提取物灌胃，50 mg/kg，連續(xù)28 d，1次/d；正常組和模型組按相同劑量灌胃生理鹽水。灌胃時(shí)注意提前禁食6 h，每天固定在同一個(gè)時(shí)間段進(jìn)行操作。

1.4記錄EEG 用BL-420N生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄EEG，戊巴比妥鈉(濃度是0.4%，按40 mg/kg給藥)麻醉成功后把大鼠頭部固定在定位儀上，在顱頂正中位置手術(shù)刀切開(kāi)約2 cm切口，暴露骨膜進(jìn)行操作。在牙科探頭介入下加上牙脫粉固定相應(yīng)的針灸電極，用直徑約0.5 mm的針灸針?lè)謩e放在右側(cè)皮質(zhì)及海馬區(qū)域即可。借助立體定位儀設(shè)置參數(shù)放置不同電極，其中，額葉皮質(zhì)中線(xiàn)旁和前囟前2.0 mm；中線(xiàn)旁2.0 mm，前囟后3.8 mm是額葉海馬電極；額葉皮質(zhì)0.5 mm、海馬2.6 mm為硬膜下電極。按要求準(zhǔn)備好后記錄EEG，每10 min記錄1次，且在大鼠清醒狀態(tài)下記錄的結(jié)果更為準(zhǔn)確。

1.5學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試 采用Y迷宮即電迷宮。原理是通過(guò)人為控制燈光和給予電刺激，讓大鼠形成條件反射，以此來(lái)判定其空間辨別能力和記憶認(rèn)知情況。該迷宮有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂，若該臂的信號(hào)燈亮了即不通電的安全活動(dòng)范圍。預(yù)先淘汰掉反應(yīng)遲鈍及過(guò)于敏感的大鼠。測(cè)試大鼠在每天的測(cè)試中達(dá)到正確反應(yīng)的達(dá)標(biāo)比率，一直連續(xù)測(cè)5 d。如果接受刺激直接跑至安全范圍內(nèi)即正確反應(yīng)，學(xué)習(xí)記憶能力強(qiáng)，反之則學(xué)習(xí)記憶能力差。若正確率達(dá)到90%可記為達(dá)標(biāo)；連續(xù)記錄5 d的達(dá)標(biāo)率。

1.6顳葉皮質(zhì)及海馬Caspase-3和Livin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 分別檢測(cè)顳葉皮質(zhì)及海馬Caspase-3和Livin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。給藥治療周期結(jié)束后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉成功后斷頭取下大腦，固定用4%多聚甲醛，并做包埋處理(用石蠟)。PBS用作一抗的孵育切片是進(jìn)行陰性對(duì)照的，測(cè)定顳葉皮質(zhì)及海馬Caspase-3和Livin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別用Caspase-3、Livin的多克隆抗體。借助醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)觀察所見(jiàn)視野，查出所在視野范圍內(nèi)所有細(xì)胞和符合陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)的棕黃色顆粒細(xì)胞，可選擇多個(gè)視野計(jì)算平均值。給出平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1EEG 正常組EEG中表現(xiàn)為低幅值的α波、β波或θ波等基礎(chǔ)波形；模型組EEG出現(xiàn)很顯著的尖波或者棘波，常會(huì)有幅值很高的棘波或慢波共存的波形；治療組EEG中尖樣波或棘波的幅值明顯較模型組降低，取而代之的是一些慢波，見(jiàn)圖1。

圖1 3組EEG結(jié)果

2.2學(xué)習(xí)記憶能力 3組連續(xù)5 d表現(xiàn)為隨著測(cè)試時(shí)間的延長(zhǎng)，每天的達(dá)標(biāo)率都逐漸增加，說(shuō)明大鼠的學(xué)習(xí)記憶與空間認(rèn)知能力日益提高；與正常組比較，相同時(shí)間點(diǎn)模型組達(dá)標(biāo)率顯著降低(P<0.05)；相同時(shí)間點(diǎn)治療組達(dá)標(biāo)率顯著高于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3顳葉皮質(zhì)及海馬Caspase-3和Livin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色的顆粒，常出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)，也在細(xì)胞核出現(xiàn)。與正常組比較，模型組皮質(zhì)及海馬體的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目都顯著增多，而海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)又顯著多于顳葉皮質(zhì)區(qū)(P<0.05)，證明海馬區(qū)是學(xué)習(xí)記憶的重要基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。治療組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組顯著降低(P<0.05)。Livin陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)出棕黃色顆粒，在皮質(zhì)部分彌散存在于顳葉皮質(zhì)各個(gè)層次；而在海馬區(qū)的表達(dá)主要遍及顆粒細(xì)胞和椎體細(xì)胞部分。治療組顳葉皮質(zhì)和海馬區(qū)Livin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組顯著增多(P<0.05)，即皮質(zhì)和海馬區(qū)Livin表達(dá)上調(diào)；而模型組的顳葉皮質(zhì)和海馬區(qū)Livin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較正常組顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組學(xué)習(xí)記憶成績(jī)測(cè)試結(jié)果、顳葉皮質(zhì)及海馬Caspase-3和livin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

3 討 論

PTZ建立的癲癇模型具備發(fā)作易感性，且與人類(lèi)發(fā)病特點(diǎn)吻合；這種藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞沒(méi)有任何細(xì)胞毒性作用，所以常用其建立該模型并探究發(fā)病機(jī)制及可行的治療藥物。癲癇發(fā)病時(shí)會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)軸突的再生與重塑而造成神經(jīng)細(xì)胞異常興奮放電，表現(xiàn)為發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多變的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙〔1〕。而參與發(fā)病的海馬區(qū)和顳葉皮質(zhì)是最具代表性、最敏感的部位。在諸多發(fā)病機(jī)制中，具有重要作用和意義的便是細(xì)胞壞死、凋亡、氧化應(yīng)激〔2，3〕、炎癥反應(yīng)〔4，5〕等，這當(dāng)中又有很多信號(hào)通路參與，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激〔6，7〕是調(diào)控氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)的主要通路之一。目前，癲癇的藥物治療一直是醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，尤其是不良反應(yīng)小的中藥開(kāi)發(fā)和治療，這也是醫(yī)藥界關(guān)注的重要問(wèn)題〔8〕。

食用與藥用兼具的百合科植物鱗莖就是蔥白，其具有減脂、對(duì)抗氧化、對(duì)抗血小板聚集、疏通微循環(huán)、舒張血管以加強(qiáng)氧供等效果。本研究說(shuō)明蔥白提取物可有效減輕大腦神經(jīng)元的異常放電來(lái)改善EEG波形變化，進(jìn)而發(fā)揮了治療癲癇的作用。

本研究中測(cè)試Y迷宮的光辨別學(xué)習(xí)記憶能力〔9，10〕的結(jié)果說(shuō)明蔥白提取物可削弱神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、增加神經(jīng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)，以此改善學(xué)習(xí)記憶。而癲癇發(fā)病時(shí)腦細(xì)胞活性顯著受到抑制并增加了細(xì)胞凋亡進(jìn)程從而學(xué)習(xí)能力減弱。同時(shí)，由于顳葉皮質(zhì)與海馬區(qū)是學(xué)習(xí)認(rèn)知的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，也是癲癇病灶的關(guān)鍵部位。本文研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了癲癇發(fā)病出現(xiàn)的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力減退和這兩個(gè)主要腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡有聯(lián)系。本研究驗(yàn)證學(xué)習(xí)記憶與皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)。因?yàn)榘d癇異常放電會(huì)同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡〔11〕。在這一過(guò)程中，神經(jīng)細(xì)胞放電異常、腦細(xì)胞缺血或缺氧也會(huì)進(jìn)一步加重凋亡。因此一旦發(fā)生癲癇首先出現(xiàn)的就是細(xì)胞凋亡〔12〕。也可根據(jù)細(xì)胞凋亡的輕重程度來(lái)判斷癲癇的病變程度〔13〕。

本研究結(jié)果提示，海馬是影響學(xué)習(xí)記憶的重要基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)；癲癇發(fā)作后的神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡主要與居于中心地位的Caspase-3密切相關(guān)，其發(fā)揮促凋亡效應(yīng)；而Livin 的效應(yīng)卻是抑凋亡的發(fā)生，原因是Caspase-3能和Livin中凋亡抑制基因重復(fù)結(jié)構(gòu)(BIR)結(jié)構(gòu)域結(jié)合而削弱 Caspase-3的正常效應(yīng)，相當(dāng)于二者發(fā)生了拮抗作用。因此證實(shí)蔥白提取物可能通過(guò)增加腦血流量、改善血流貯備、加強(qiáng)腦組織血液循環(huán)和氧供應(yīng)、建立側(cè)支循環(huán)來(lái)降低神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡，以起到神經(jīng)保護(hù)和治療效果。

綜上，癲癇以海馬區(qū)細(xì)胞凋亡為主要表現(xiàn)形式，由于這個(gè)腦區(qū)又是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)部位，因此在癲癇發(fā)生時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低。而蔥白提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)EEG波形的改變，營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞緩解細(xì)胞凋亡的發(fā)生來(lái)增加學(xué)習(xí)記憶能力；從而達(dá)到神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)效果。