大鼠心肌梗死后迷走神經重構及毛果蕓香堿的心臟保護作用

孫責 于海波 薛晴 于海濤 賈琳琳 王芳芳 關政 李晶，4

(佳木斯大學 1附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154007；2研究生院； 3基礎醫學院；4黑龍江省微生態-免疫調節網絡與相關疾病重點實驗室)

心血管疾病發病率在不斷增加〔1～4〕，致殘率和致死率在全球范圍呈現高趨勢發展的就是急性心肌梗死(AMI)〔5〕。要降低這些概率就要及時發現、正確診斷和治療〔6〕。由于冠狀動脈缺血缺氧后會有心肌壞死(臨床表現為典型的胸骨后疼痛)而誘發心力衰竭，進而危及生命〔7〕，最終造成機體死亡〔8，9〕。由于AMI是心血管疾病患者死亡的主要原因〔10〕，目前常規傳統的治療方法已取得一定成效，如溶栓、藥物、介入手術、冠狀動脈搭橋術等。但對一些特殊病變(如彌漫性、復發性、多支病變)傳統治療方法效果并不好〔11，12〕，造成患者生活質量明顯下降〔13〕。而自主神經異常，尤其是迷走神經重構與心肌梗死后患者猝死關系緊密，由于迷走神經節后纖維釋放遞質乙酰膽堿作用于心肌細胞的M受體而發揮作用；研究發現對很多心血管病起到保護作用的是M3受體，作為M3受體激動劑的毛果蕓香堿(pilcocarpine)目前主要用于臨床眼科治療(青光眼)、口干燥癥、阿托品中毒等〔14〕，其對心臟的保護作用和內臟痛的治療研究甚少。因此，本研究探討大鼠心肌梗死后迷走神經重構及毛果蕓香堿的心臟保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 30只雄性SPF級SD大鼠(體重約220 g)，購自哈爾濱醫科大學實驗動物中心，合格證書：SYXK(黑)2018-001，實驗經過佳木斯大學倫理委員會批準，并依據實驗動物的3R 原則施行人道主義關懷。

1.2主要試劑與儀器 鹽酸毛果蕓香堿(上海阿拉丁生活科技股份有限公司)；戊巴比妥鈉(天津施維雅制藥有限公司)；注射用青霉素(哈藥集團制藥總廠)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒96T(南京建成生物公司)；PL-200 熱刺痛儀(成都泰盟科技有限公司);2390型電子機械性痛敏儀(美國IITC公司)；BL-420F生物機能實驗系統及HX-300S小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；各類哺乳動物手術器械：手術剪、眼科剪、鑷子、止血鉗、持針器、手術線、注射器、眼科開瞼器、擴胸器等。

1.3動物分組與模型建立 大鼠在做手術前均需要禁食、禁水12 h。梗死組模型建立方法：用30 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后背位固定在手術臺上，借助小兒喉鏡經口進行氣管插管，并連好小動物呼吸機(呼吸比調成1∶1，潮氣量調成15 ml)，同步記錄心電圖(ECG)改變(BL-420F 生物信號采集放大系統)。在左側第4、5肋間隙消毒后開胸，剪破心包膜以便暴露心臟，用7號無菌手術線結扎左前降支冠狀動脈(不可過深或過淺，約厚0.5 mm、寬2.0 mm)，若結扎成功肉眼可見心尖部位缺血后顏色變白、搏動減弱，同時能看到ECG中ST段顯著高抬〔15〕。假手術組術前準備和梗死組一樣，區別在于開胸后看到左冠狀動脈前降支后不需要結扎，只是把手術線從其下方穿過即可。毛果蕓香堿組術前操作步驟及手術方法和梗死組一樣，不同在于模型建立成功后需要舌下靜脈注射毛果蕓香堿，按 0.2 mg/kg持續給藥28 d。

1.4描計ECG方法 運用BL-420F 生物信號采集放大系統描計，把大鼠用戊巴比妥鈉麻醉成功后，以仰臥位方式固定在大鼠手術臺上，將1 ml注射器針頭分別插入大鼠的兩前肢和右后肢皮下，并且連接不同顏色電極后借助實驗系統輸出相應的電信號即ECG改變(標Ⅱ導聯)，具體電極連接方法是右前肢連白色，右后肢連黑色，左后肢連紅色。

1.5檢測血清LDH、脂肪酸結合蛋白(FABP)變化 血清LDH、FABP含量的檢測用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。具體操作步驟如下：做完實驗后各組大鼠取血，離心機離心(3 000 r/min離心10 min)后取上清液備用。按說明書要求，首先加上待檢測樣品、標準品與平行樣本稀釋，以加入辣根過氧化物酶一抗作為標志，37℃ 60 min孵育，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗板5次，37℃避光條件下孵育15 min后加入二抗，后加入顯色液及終止液，最后用酶標儀測定OD值。

1.6梗死面積測定 取大鼠心臟分離出心室，以左心室為例，切割2 mm每份的組織(從心尖一直到心底)，在37℃溫度下用氯化三苯基四氮唑溶液中孵育10 min，在多聚甲醛中固定24 h。視覺觀察到梗死部分心肌組織變白，而非梗死部分是紅色的。梗死面積大小測定借助BI-2000醫學圖像分析系統，具體計算公式為每片切片梗死心肌之和/整個左心室面積×100%。

1.7迷走神經支配密度、M3受體mRNA 迷走神經支配密度(μm2/mm2)的測定用Motic Images3000計算機輔助圖像分析系統，等于神經纖維面積/總檢測面積。即免疫組化定量分析，組化按常規操作：固定在甲醛溶液中后脫水、浸蠟、包埋后切片，30 min預熱，15 min抗原修復后冷卻1 h，加一抗后加酶標二抗，中間用PBS沖洗，最后二氨基聯苯胺(DAB)顯色，陽性為棕色顆粒。M3受體mRNA檢測：用試劑盒提取總 RNA，質量分析用凝膠電泳，純度和含量測定用紫外分光光度計。逆轉錄反應處理總RNA，其反應產物用于聚合酶鏈反應(PCR)，密度掃描及UV 照相是把PCR產物借助瓊脂糖凝膠后電泳的結果，mRNA相對表達量以M3受體和內參電泳條帶的灰度值計算。

1.8機械痛閾與熱痛閾的測定 安靜室內，適宜溫度和濕度，借助PL-200 熱刺痛儀檢測，計算由于輻射熱源刺激大鼠造成縮足反射所需要的時間，即熱痛閾。機械痛閾的測定是用美國 IITC 公司生產的 2390 型電子機械性痛敏儀進行，主要計算兩后爪的縮足閾值，具體操作為：把大鼠放在透明的有機玻璃盒子中，盒子底部是框架結構，可放入刺激探針。先讓大鼠適應這個環境，把直徑 0.5 mm探針緩慢垂直抬高，直至碰到大鼠后腳掌中心，刺激強度逐漸加大，直到大鼠腳趾縮回去記錄當時的壓力值。基礎痛閾的測定在術前1 d進行。

1.9統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.13組ECG改變情況 與術前比較，梗死組ECG出現明顯抬高的ST段；毛果蕓香堿組抬高的ST段較梗死組顯著下降；假手術組未出現明顯ST段。

2.23組梗死面積百分率 梗死組心肌梗死面積為(48.93±5.02)%，毛果蕓香堿組為(25.67±4.15)%，假手術組為(0.00±0.00)%，3組梗死面積百分率差異有統計學意義(P<0.05)。

2.33組血清LDH、FABP變化 與假手術組比較，梗死組與毛果蕓香組血清LDH、FABP水平顯著升高(P<0.05)；與梗死組比較，毛果蕓香堿組血清LDH、FABP顯著下降(P<0.05)，見表1。

2.43組迷走神經支配密度、M3受體mRNA變化 與假手術組比較，梗死組迷走神經支配密度、M3受體mRNA相對表達量顯著增加；與梗死組比較，毛果蕓香堿組二者表達均顯著降低(均P<0.05)，見表1。

2.53組機械痛閾、熱痛閾的改變 治療前，3組基礎痛域無明顯差異(P>0.05)；治療后，毛果蕓香堿組內臟疼痛明顯緩解；與梗死組比較，毛果蕓香堿組機械痛閾顯著增加，熱痛閾顯著降低(均P<0.05)，見表2、表3。

表1 3組外周血血清中LDH、FABP含量及迷走神經支配密度、M3受體mRNA相對表達量比較

表2 3組機械痛閾改變

表3 3組熱痛閾改變

3 討 論

起病危重的AMI最容易出現并發癥，致死率很高〔16，17〕。其發生在于不同誘因造成冠狀動脈血流不夠，出現壞死、水腫、充血，同時伴隨炎細胞的出現，導致心肌纖維化，大大降低心功能，表現為心力衰竭。而心力衰竭的出現可能與炎細胞過度激活進而誘導心肌細胞凋亡、壞死有關〔18,19〕。通常情況下，重構或壞死、水腫的心肌一般不能全部恢復正常，因為心肌再生能力有限。另外，一旦心肌出現壞死，還可能出現在壞死部分或壞死周圍有一小部分還存活的心肌細胞，這也是AMI出現心律失常的原因。同時，AMI后會伴隨心前區的內臟疼痛。因此，AMI研究關鍵是藥物治療改善癥狀的同時還要具有減輕內臟疼痛的效果。

AMI發生時，由于壞死和缺血的影響可造成迷走神經的損傷和再生的過程，而自主神經的異常又是造成猝死和心律失常的主要誘因。本研究證明毛果蕓香堿具有減輕迷走神經重構，加強再生的神經正常化支配，進而減低并發癥和猝死的出現。M3受體可與乙酰膽堿(Ach)遞質結合，調節心肌細胞的生理特性(興奮、傳導、收縮性)，同時能介導鉀離子通道。本研究提示在病理狀態下心肌 M3受體表達會增加，也可能和心肌缺血壞死后鉀電流密度增加有關；經毛果蕓香堿M3受體激動劑治療后降低，證實毛果蕓香堿能夠減弱M3受體mRNA相對表達量，進而調節心肌細胞的生理特性來降低AMI并發癥的出現。

生化指標檢測在AMI中作用也很大，LDH能判斷心肌是否損傷；心臟型脂肪酸立即釋放，臨床上對肺栓塞、腦卒中的診斷及預后價值較大〔20，21〕。它是判定缺血具有高靈敏度的指標。本研究發現：毛果蕓香堿組與梗死組比：血清LDH、FABP下降，可能原因是作為脂質代謝調節因子的FABP可造成脂質代謝紊亂，生成氧自由基，進而造成細胞損傷出現氧化應激反應，破壞正常的心功能引起AMI〔22～24〕。通常情況下，各種社會、心理、身體等諸多因素都會影響痛閾的變化〔25〕，而這些變化的發生都和痛覺的內源性調控相關，在這個系統中存在抑制系統和易化系統，且二者始終處在一種動態平衡狀態，因而在一定范圍內，生物個體都具有穩定的痛閾。目前，臨床鎮痛手段有超前鎮痛，即把自身內源性鎮痛機制及時啟動來達到止痛效果。本研究顯示AMI大鼠內臟痛的變化，說明毛果蕓香堿能夠啟動并激活內源性調控系統中的抑制機制來降低痛感，減輕痛苦。

綜上，毛果蕓香堿可借助LDH、FABP水平的下降來削弱心肌損傷和缺血；通過減弱M3受體mRNA相對表達量、減輕迷走神經重構來降低AMI并發癥的出現；通過調節痛閾來降低疼痛感。因此，毛果蕓香堿具有心肌保護和緩解疼痛的作用，為AMI治療及疼痛緩解提供了科研依據。