大鼠骨骼肌挫傷修復(fù)過程中p38MAPK通路、炎癥反應(yīng)的作用

王嶼萌 廖苾芝 周達(dá)岸

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院康復(fù)中心，遼寧 錦州 121000)

骨骼肌鈍挫傷是由急性、機(jī)械性的頓力造成的損傷，隨之產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平發(fā)生變化，其特征是皮膚無破損，無外部損傷〔1〕。骨骼肌損傷修復(fù)主要源于肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化，從原有骨骼肌中進(jìn)行分離培養(yǎng)獲得的肌衛(wèi)星細(xì)胞增生細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)被人們統(tǒng)稱其為成肌細(xì)胞,這類細(xì)胞在機(jī)體未受到傷害或刺激時(shí)仍然處于正常靜止活動狀態(tài),損傷或突變發(fā)生時(shí)會被激活,具備自我復(fù)制和增殖多向細(xì)胞分化的巨大潛能,可以進(jìn)一步進(jìn)行增殖單向分化，修復(fù)受損肌組織，達(dá)到治療效果〔2,3〕。已有研究表明p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑在骨骼成肌細(xì)胞的生長中起著重要作用，在成肌細(xì)胞增殖與分化中扮演重要角色〔4〕。沖擊波(ESW)是近幾年興起的對肌肉骨骼系統(tǒng)疾病有效的一種新興治療技術(shù)，ESW能夠有效影響細(xì)胞增殖與分化，抗炎，擴(kuò)張血管及血管生成，緩解疼痛，神經(jīng)修復(fù)與再生，加速成骨〔5～10〕。為此本實(shí)驗(yàn)首次以ESW作為干預(yù)手段，研究p38MAPK信號通路及炎癥因子在骨骼肌鈍挫傷修復(fù)時(shí)的表達(dá)變化，探討利用ESW對急性骨骼肌鈍挫傷的修復(fù)治療機(jī)制作用及其機(jī)制,為臨床治療骨骼肌損傷修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物與分組 于錦州醫(yī)科大學(xué)IVC動物實(shí)驗(yàn)室購買60只健康飼養(yǎng)雄性SD大鼠，8～9 周齡，體重180～200 g，飼養(yǎng)溫度控制在20～25℃，濕度40%～50%，動物飼養(yǎng)生產(chǎn)經(jīng)營許可證注冊號：SCXK(遼)2017-0003。60只大鼠隨機(jī)分為正常組(n=12)、損傷組(n=24)和治療組(n=24)，其中損傷組與治療組，每組按照1 d、3 d、7 d、14 d時(shí)間點(diǎn)分為4個(gè)亞組。實(shí)驗(yàn)操作符合錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理與福利委員會章程。

1.2主要試劑和儀器 p-38MAPK一抗 、肌細(xì)胞生成素(Myogenin)一抗、β-actin(美國，abcam)，磷酸化(p)-p38MAPK一抗(美國，CST)，山羊抗兔二抗(上海，碧云天)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(上海，酶聯(lián)生物)，Western印跡相關(guān)試劑(上海，碧云天)，光學(xué)顯微鏡(日本，Olympus公司)，電泳及轉(zhuǎn)膜儀器(美 國，BIO RAD 公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國，BIO RAD公司)，體外沖擊波治療儀(瑞士，EMS公司)。

1.3急性鈍挫傷模型建立 依照Liu等〔11〕方式，采用自置重物裝置打擊腓腸肌肌腹。打擊物重 16.8 g(直徑15.9 mm)，下落高度125 cm，打擊頭面積約28.26 mm2。這種方法導(dǎo)致的損傷是一種高效鈍性創(chuàng)傷，伴隨著炎癥細(xì)胞侵入，之后廣泛的肌肉再生〔12〕。各組于不同時(shí)間點(diǎn)(第1、3、7、14天)取腓腸肌肌腹。

1.4治療措施及取材 正常組未給予干預(yù)；損傷組不給予治療；治療組大鼠于損傷后24 h采用發(fā)散式?jīng)_擊波刺激，作用于大鼠腓腸肌中段。設(shè)定參數(shù)〔13〕：能流密度0.14 mJ/mm2，頻率10 Hz，每次沖擊500次，每間隔4 d進(jìn)行1次治療，于1 d、3 d、7 d、14 d時(shí)取大鼠局部腓腸肌進(jìn)行檢測(其中1 d取材時(shí)于治療結(jié)束后即刻進(jìn)行)。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色組織學(xué)觀察 將腓腸肌肌腹固定在4%的多聚甲醛1 h后，石蠟包埋切片(5 μm)并HE染色，在光鏡下觀察組織病理學(xué)改變并采集圖像。

1.6Western印跡法 每組分別取100 mg樣本，加入適量高效RIPA裂解液，加入100 μl的pH為7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用勻漿器充分勻漿，離心取上清液并進(jìn)行蛋白定量。電泳開始以90 V恒壓1 h，待擴(kuò)散后，120 V恒壓2 h，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))，用300 mA恒流1.5 h，電泳后，將膜放入5%脫脂奶粉溶液中1.5 h，TBST洗膜后分別在p38MAPK(1∶1 000)、p-p38MAPK(1∶1 000)、Myogenin(1∶500)、β-actin(1∶1 000)一抗稀釋液中4℃搖床孵育過夜；放入二抗(1∶1 000稀釋)在室溫下放置1 h；電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影后成像。Image J 軟件分析每個(gè)目的蛋白灰度值。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 取凍存于-80℃冰箱中的血清，按試劑盒說明書依次加入空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，除空白孔，其余孔加酶標(biāo)試劑，密封，37℃孵育60 min。配制溶液，清洗，依次向每個(gè)孔中加入顯色劑A和B，輕輕搖勻，顯色，然后加入終止液。在450 nm波長下測量每個(gè)孔的吸光度(OD值)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肌肉形態(tài) 正常組：肌肉組織結(jié)構(gòu)正常完整，肌纖維走形整齊，無組織變性、壞死等明顯病理結(jié)構(gòu)改變。損傷組較正常組：肌纖維排列紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤。治療組較損傷組：隨著治療進(jìn)展，肌纖維排列較規(guī)則，炎細(xì)胞減少。見圖1。

2.2各組p38MAPK、p-p38MAPK、Myogenin表達(dá)比較 損傷組和治療組的p38MAPK、p-p38MAPK、Myogenin表達(dá)量均高于正常組(P<0.01)，同一時(shí)間點(diǎn)下，治療組p38MAPK、p-p38MAPK、Myogenin的表達(dá)量相對于損傷組均顯著增高(P<0.05)，損傷組和治療組p38MAPK、p-p38MAPK、Myogenin均在3 d表達(dá)量達(dá)到峰值(P<0.01)。見表1、圖2。

圖1 不同組別腓腸肌HE染色(×200)

表1 各組p38、p-p38、Myogenin蛋白及TNF-α、IL-1β含量比較

1～9：正常組，損傷1、3、7、14 d組，治療1、3、7、14 d組

2.3炎性細(xì)胞因子水平 損傷組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-1β的表達(dá)量與正常組比較均有顯著性差異(P<0.01)，且均在損傷1 d達(dá)高峰(P<0.05)。治療組TNF-α、IL-1β相對于損傷組除第1天增高(P<0.05)，3 d、7 d、14 d都呈下降趨勢且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

3 討 論

ESW作為一種新型治療技術(shù)，具有高效、安全、多用途、可重復(fù)、無創(chuàng)等特點(diǎn)，近年來，廣泛應(yīng)用于治療許多肌肉骨骼疾病之中〔14〕。ESW作為一種具備力學(xué)性質(zhì)的機(jī)械波〔15〕，通過機(jī)械傳導(dǎo)，以誘導(dǎo)新血管生成和干細(xì)胞活動，從而改善組織再生和愈合。已證明ESW上調(diào)Myogenin的表達(dá)，促進(jìn)急性骨骼肌損傷后再生〔16〕。同時(shí)，也有研究表明ESW在體外實(shí)驗(yàn)對成肌細(xì)胞具有一定促進(jìn)增殖與分化作用〔17〕。p38MAPK信號通路在促進(jìn)成肌細(xì)胞分化、肌管生成、衛(wèi)星細(xì)胞增殖方面都發(fā)揮著重要作用〔18，19〕。雖然沒有研究表明ESW對MAPK激活的影響，但上述所有研究都表明，ESW可以通過激活p38MAPK途徑來促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的可能性。且體外成肌細(xì)胞不能完全代替體內(nèi)肌衛(wèi)星細(xì)胞， 成肌細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞之間在細(xì)胞成熟水平方面存在顯著差異〔20〕。 本研究結(jié)果表明ESW通過促進(jìn)p38MAPK表達(dá)進(jìn)而直接調(diào)節(jié)MAPK級聯(lián)反應(yīng)，致使磷酸化，從而調(diào)節(jié)肌細(xì)胞增殖。通過促進(jìn)Myogenin增殖即提高肌源性調(diào)節(jié)因子表達(dá)〔21〕，達(dá)到組織愈合目的。炎癥細(xì)胞因子在骨骼肌修復(fù)再生的中也起著至關(guān)重要的作用，雖然抗炎策略的發(fā)展已被廣泛認(rèn)為是提供組織拯救的主要工具，但也必須記住，及時(shí)實(shí)施促炎模式在組織修復(fù)中也起著關(guān)鍵作用〔22〕。近年來，觀察到ESW能通過上調(diào)人牙周膜中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖〔23〕。眾所周知，在應(yīng)激期間，細(xì)胞會發(fā)生各種反應(yīng)，包括炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)ESW的作用可以初期觸發(fā)促炎癥因子的激活，ESW啟動的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)可能通過促炎誘導(dǎo)促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，然而長期炎癥反應(yīng)損害機(jī)體修復(fù)，導(dǎo)致瘢痕增生，是促炎與抗炎失調(diào)〔24〕，為此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ESW后期治療整體都是下降的。根據(jù)這些觀察，ESW可能初期刺激炎癥因子的活性也就可以理解了，所有這些結(jié)果表明，ESW可能正向調(diào)控骨骼肌修復(fù)過程的初始有益炎癥反應(yīng)〔25〕，并使肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化“合理化”。

綜上，經(jīng)ESW預(yù)后，p38MAPK信號通路被更大程度激活，調(diào)控 Myogenin表達(dá)增加，增強(qiáng)骨骼肌再生修復(fù)。同時(shí)減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)修復(fù)愈合過程。ESW可通過p38MAPK信號通路促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，同時(shí)減輕炎癥反應(yīng)，到達(dá)治療目的，ESW在減輕肌肉挫傷的炎癥和促進(jìn)肌生成方面具有雙重作用。