基于網絡藥理學探討人參治療骨質疏松的作用機制

劉震坤 張兆鵬 胡博 白金萍 郭軍鵬

(1吉林省中醫藥科學院，吉林 長春 130021；2長春中醫藥大學)

骨質疏松(OP)是由激素失調、營養不良、免疫功能紊亂、遺傳等引起的骨退行性疾病，但究竟何種因素是主要原因及其作用機制還有待于進一步研究證實〔1〕。因此，OP已被WHO列為三大老年病之一。治療原則是早發現、早預防、早治療，盡量避免骨折等嚴重并發癥的發生。早期發現與預防及發病后的綜合性治療是OP防治的關鍵〔2〕?，F代醫學對OP病因、發病機制和治療進行了大量研究，但防治效果仍不理想〔3〕。OP的癥狀和體征與中醫“骨痿”“骨枯”“骨痹”等描述比較相似，主要由腎精虧虛、脾胃虛弱等引起，治則以補腎、填精、益髓為根本〔4～7〕。人參是補虛中藥典型代表，臨床常用其強身健體、延緩衰老。本研究基于網絡藥理學技術，篩選人參有效成分和抗OP靶點基因，構建人參抗OP靶點基因和其編碼蛋白的網絡結構圖，富集分析了人參有效成分治療OP的核心靶點基因及信號通路，為人參的現代化研究與開發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1人參中有效成分的篩選和靶點的預測 在中藥系統藥理學分析和預測平臺(TCMSP)檢索“人參(Ginseng)”，以口服利用度(OB)>30%，藥物類藥性(DL)>0.18為篩選條件，對人參有效成分進行篩選。然后借助TCMSP在線藥物成分靶點預測和Perl語言，對人參主要成分的作用靶點進行預測。利用UniProt數據庫對篩選出的有效靶點進行基因名的添加。如果在數據庫中找不到相應的靶點基因名，則視為不存在或無效靶點。

1.2獲取OP靶點基因 在GeneCards數據庫、OMIM數據庫檢索“Osteoporosis(骨質疏松)”，整理所得疾病靶點相關基因，得到OP靶點基因。

1.3人參靶點基因與OP靶點基因交集 通過R語言軟件獲得中藥-OP共同靶點基因，結果以Venn圖呈現。

1.4人參-OP靶點基因調控網絡 借助Perl語言映射人參-OP共同靶點基因，應用Cytoscape可視化軟件得到人參-OP調控網絡圖，其中各個節點包括人參、人參有效成分、人參靶點基因、OP靶點基因、人參-OP共同靶點基因。

1.5構建蛋白互作網絡圖 通過STRING數據庫構建人參-OP靶點基因編碼蛋白與其他蛋白相互作用的網絡(PPI)。利用R語言處理STRING數據庫所得文件，得到蛋白互作網絡相關核心基因的條形圖，同時獲得核心靶點基因名稱。

1.6GO和KEGG通路富集分析 用R語言將中藥-疾病共同靶點基因進行處理計算，通過DAVID數據庫進行GO富集分析，對共同靶點基因從位置、功能和參與生物學過程等方面進行分類和闡釋，靶點基因參與的生物學過程以坐標氣泡圖呈現。KEGG通路富集分析結果取P<0.05前Top20的信號通路。

2 結 果

2.1人參有效成分及相關靶點篩選 通過TCMSP數據庫檢索，根據OB和DL參數篩選人參主要有效成分，共計22種，見表1。

2.2中藥靶點基因和疾病靶點基因交集 由Venn圖得到4 659個疾病相關靶點基因，52個中藥相關靶點基因，共同作用靶點基因34個。

2.3中藥-疾病調控網絡構建 用Cytoscape可視化軟件可得到中藥疾病調控網絡圖，見圖1。八邊形代表OP，箭頭代表中藥人參，六邊形代表人參的有效成分，圓形代表人參-OP共同靶點基因。

表1 通過TCMSP數據庫篩選人參主要有效成分

圖1 中藥-疾病-靶點調控網絡

2.4人參-OP靶點基因編碼蛋白互作網絡分析 PPI中與其他節點聯系較多的節點，即是核心靶點基因蛋白。條形圖顯示主要有：絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)8、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3、RELA基因、細胞間黏附分子(ICAM)1、細胞色素P450超家族(CYP)基因等，見圖2、3。

圖2 人參治療OP的靶點基因蛋白互作網絡

2.5GO富集分析 GO富集分析GO富集顯示人參治療骨質疏松核心靶點基因在生物活性方面主要集中在：有機物質的反應、細胞死亡的調節(包括凋亡等)；在細胞成分方面主要集中在細胞質中的成分；在細胞核功能方面主要集中在轉錄調節活性方面，見圖4。

圖3 蛋白互作網絡核心基因條圖

圖4 GO富集坐標氣泡圖

2.6KEGG通路富集分析 人參治療OP的信號通路主要涉及：腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、核因子(NF)-κB信號通路、癌癥相關信號通路、乙型肝炎相關信號通路、MAPK信號通路、化學致癌相關信號通路、弓形蟲NOD樣受體信號通路等，見圖5和6。

圖5 KEGG功能富集分析柱狀圖

圖6 KEGG富集氣泡圖

3 討 論

本研究從TCMSP數據庫篩選獲得人參治療OP的有效活性成分22個，人參-OP共同作用靶點基因34個，其中核心靶點基因有MAPK家族基因、CYP家族基因、caspase-3基因、RELA基因、ICAM1基因等，GO和KEGG Pathway富集分析發現這些基因主要通過TNF信號通路、NF-κB信號通路、癌癥相關信號通路等信號通路影響核受體活性、類固醇激素受體活性、肽鏈內切酶活性而影響OP的發生和發展。TNF-α與其受體結合通過多條信號通路參與細胞生理功能的調節〔8〕。TNF-α對骨代謝具有雙向調節作用，主要取決于TNF-α濃度和應答反應的細胞所處分化階段。TNF-α與RANKL能夠通過不同信號通路激活NF-κB而促進破骨細胞的分化和成熟。TNF-α通過抑制Runx2和成骨細胞相關轉錄因子、上調Smurf1表達而抑制成骨細胞與前體細胞的分化和成熟〔9〕。有研究表明，低濃度TNF-α能夠誘導BMSCs中BMP-2的表達，加快成骨細胞的產生，提高堿性磷酸酶(ALP)水平而促進細胞外基質的礦化，對OP的治療起促進作用〔10〕。MAPK是成骨細胞分化的正調節因子，能夠增強ALP的表達，促進骨組織鈣化。MAPK信號通路還能夠激活成骨細胞分化必需因子Runx2的表達而促進骨形成〔11〕。

綜上，人參有效成分治療OP并不是通過單一基因或者單一信號通路的作用，而是多個基因和多個信號通路共同作用的結果。本研究篩選和富集了人參治療OP可能的靶基因和信號通路，為今后研究人參治療OP提供新的方向和思路。