鴉膽子苦醇通過RhoA/ROCK1信號通路抑制人結直腸癌細胞HCT-116的侵襲和遷移

盧睿瑾，杜玉梅，黃世瑩，唐加峰,3，張 滔,3，，何 爽，徐 航,，陳地龍,3，冉建華，李 靜

(重慶醫科大學 1.基礎醫學院組織學與胚胎學教研室、2.公共衛生與管理學院，重慶 400016；3.重慶三峽醫藥高等?？茖W校，重慶 404120；4.重慶醫科大學基礎醫學院解剖學教研室，重慶 400016)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤，每年導致近70萬人死亡，是世界上第四大致命癌癥。在過去的十年里，隨著結直腸癌的發病率逐年升高，雖然很多新興化療藥物的使用延長了晚期結直腸癌患者的平均存活時間，但患者通常在3年內死亡[1]。目前，結直腸癌的治療方式主要是以手術為主的綜合治療，但術后的復發和轉移仍是結直腸癌患者死亡的主要原因。在轉移性結直腸癌的治療方面，西妥昔單抗和伊立替康等常用藥物取得了較好的臨床療效，但容易發生耐藥[2]。不良的治療結果提示需要更好地理解導致結直腸癌的發生、發展、轉移和擴散的機制。

中藥鴉膽子為苦木科植物鴉膽子的干燥成熟果實，始載于《本草綱目拾遺》，又名老鴉膽、苦參子等。性寒味苦，具有清熱解毒、抗腫瘤，抗瘧疾等作用[3]。鴉膽子苦醇(brusatol，BRU)是一種從鴉膽子油中提取的重要化合物，同時具有多種生物學效應，包括抑制腫瘤細胞生長、減少瘧疾對位點的復制、減輕炎癥和抵抗病毒入侵等[4]。目前已有研究報道中藥鴉膽子苦醇對肝癌[5]、胰腺癌[6]和鼻咽癌[7]等多種腫瘤有抑制作用。但對結直腸癌的研究報道甚少，且作用機制尚不明確。所以本研究擬探討鴉膽子苦醇對結直腸癌細胞遷移和侵襲的影響和可能的作用機制，以期為結直腸癌的治療靶點和新藥的開發提供理論依據。

1 材料

1.1 細胞株HCT-116結直腸癌細胞由課題組實驗平臺提供。

1.2 藥物與試劑鴉膽子苦醇由三峽醫藥高等?？茖W校饋贈。高糖培養基DMEM購自美國Hyclone公司，南美胎牛血清(10270-106,Gibco)購自美國賽默飛公司，二甲基亞砜(DMSO)、RIPA裂解液強(P0013B)、青-鏈霉素(C0222)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S)和蛋白酶磷酸酶抑制劑(P1048)均購自上海碧云天生物技術有限公司，PAGE凝膠快速制備試劑盒和無蛋白快速封閉液均購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司。一抗抗體MMP2(40994S)、MMP9(13667S)購自美國CST公司，RhoA(AF2179)、ROCK1(AF1795)和ROCK抑制劑(Y37632)購自上海碧云天生物科技有限公司，二抗抗體購自美國CST公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8,HY-K0301)購自MCE公司。Transwell小室(孔徑8.0 μm)和Matrigel膠(356234)均購于Corning公司。

1.3 儀器恒溫孵箱(Thermo)；高速臺式離心機；低溫高速離心機(平凡儀器，TGL-185)；M450酶標測定儀、凝膠成像系統、Western blot電泳儀、電轉儀(美國Bio-Rad公司)；DMi8倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 細胞培養HCT-116細胞復蘇后，在DMEM培養基(含10%胎牛血清)中培養。將細胞置于37 ℃、5% CO2的孵箱中，每48-72 h傳代1次。

2.2 CCK-8法檢測細胞增殖取對數期生長的HCT-116細胞，調整細胞數為5×103/孔，平鋪于96孔細胞培養板中，每孔加入100 μL培養基。將實驗分為3組，每組3個復孔?？瞻讓φ战M：不接種細胞，不加入BRU，僅含有DMEM完全培養基；對照組：僅接種細胞和DMEM完全培養基，不加入BRU；實驗組：接種的細胞加入含終濃度為2.5、5、10、20、40、80、160、320 nmol·L-1BRU的DMEM完全培養基。分別培養24、48、72 h后，將10 μL CCK-8的工作液分別加入每孔中，置于37 ℃孵育2 h。在450 nm處測定其吸光度值(A)。計算24、48、72 h細胞生長抑制率，抑制率%=(A對照組-A實驗組)/(A對照組-A空白對照組)×100%，實驗重復3次。

2.3 劃痕實驗用胰酶消化處于對數生長期的HCT-116細胞,將細胞計數后，每孔接種5×104個細胞于6孔板中,待細胞長滿后,用滅菌的200 μL槍頭在細胞單層的中央區域劃一道直線劃痕，PBS洗滌后，添加含不同終濃度BRU(3、6 nmol·L-1)的無血清DMEM培養液，對照組則加入含等體積的無血清DMEM培養液，每組取一盤細胞在劃痕后立即在倒置顯微鏡下觀察、拍照，其余細胞置于5% CO2、37 ℃恒溫孵箱中培養24 h，在倒置顯微鏡下觀察，并隨機選擇5個視野拍照，用ImageJ軟件計算劃痕面積，并計算各組的相對遷移率，相對遷移率/% =(各藥物組0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/(對照組0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)×100%。

2.4 Transwell侵襲實驗用無血清的DEME培養基按8 ∶1的比例稀釋Matrigel膠并充分混勻,將混合液均勻鋪于Transwell小室膜上,每孔100 μL，置于37 ℃的條件下 4 h，待其凝固。用胰蛋白酶消化HCT-116細胞，無血清培養基重懸后,在Transwell小室的上室中每孔接種5×104個細胞和含不同終濃度BRU(0、3、6 nmol·L-1)的無血清培養基。在每孔的下室加入500 μL DMEM(含20%胎牛血清)培養基,置于孵箱中培養24 h后,用棉花輕輕擦掉上室中未侵襲的細胞，室溫下用4%多聚甲醛固定小室的底部15 min,PBS漂洗1-2次,結晶紫染色15 min,顯微鏡下每組隨機選取5個視野觀察并拍照。

2.5 Western blot檢測將HCT-116細胞分為3組，分別加入含不同終濃度BRU(0、3、6 nmol·L-1)的DMEM完全培養基,放細胞孵育箱24 h后收集細胞；再將HCT-116細胞分為4組，分別為對照組，加藥組(BRU)，抑制劑組(Y27632)，加藥和抑制劑組(BRU+Y27632)，先后提取蛋白進行SDS-PAGE電泳,然后電轉至PVDF膜上，在室溫條件下，用無蛋白快速封閉液封閉15 min，分別加入稀釋比例均為1∶1 000的一抗MMP2、MMP9、RhoA、ROCK1和GAPDH，置于4 ℃冰箱的搖床過夜。用TBST液洗滌3次后,加入適量稀釋比例為1 ∶10 000的二抗，在室溫狀態下放入搖床孵育1 h，再用TBST液洗滌3次，使用ECL系統檢測蛋白表達量。實驗重復3次。

3 結果

3.1 BRU對HCT-116細胞增殖的影響如Fig1所示，使用CCK-8法檢測不同濃度的BRU作用于HCT-116細胞24、48、72 h后，與對照組相比，HCT-116細胞的抑制率隨著BRU作用時間和濃度的增加而逐漸增加。計算BRU作用于HCT-116細胞24、48、72 h的IC50分別為16.62、15.11、13.42 nmol·L-1，24 h的IC10為6 nmol·L-1，所以后續選用6 nmol·L-1作為最大藥物處理濃度。

Fig 1 Effect of BRU on proliferation of HCT-116 cells by

3.2 BRU抑制HCT-116細胞的遷移劃痕實驗檢測BRU對HCT-116細胞遷移能力的影響。如Fig2所示，使用0(對照組)、3、6 nmol·L-1的BRU處理HCT-116細胞24 h后，各組的相對遷移率為(49.3±1.5)%、(31.2±10.4)%、(8.9±2.6)%。與對照組相比，加藥組細胞遷移率逐漸降低，差異有統計學意義(P<0.05)。提示BRU能夠明顯抑制HCT-116細胞的遷移。

Fig 2 Effect of BRU on HCT-116 on migration of colorectal cancer cells by wound healing n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control

3.3 BRU抑制HCT-116細胞的侵襲將Matrigel膠稀釋后均勻鋪在Transwell小室的上室中，用于檢測HCT-116細胞的侵襲能力。如Fig3所示，使用0(對照組)、3、6 nmol·L-1的BRU處理HCT-116細胞后，各組的每視野下侵襲過膜細胞數為(760±26)個、(532±57)個、(353±8)個。與對照組相比，加藥組中HCT-116細胞的侵襲能力明顯減弱，差異有統計學意義(P<0.01)。提示BRU能夠顯著抑制HCT-116細胞的侵襲。

Fig 3 Effect of BRU on invasion of HCT-116 colorectal cancer cells by Transwell n=3)**P<0.01 vs control

3.4 BRU對HCT-116細胞中遷移侵襲相關蛋白MMP2、MMP9表達的影響用不同濃度的BRU(0、3、6 nmol·L-1)處理HCT-116細胞24 h后，Western blot檢測結果顯示，與對照組(即0 nmol·L-1BRU處理組)相比，經BRU處理后的加藥組中的MMP2、MMP9蛋白的相對表達量均明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果提示BRU可以抑制遷移侵襲相關蛋白的表達。見Fig4。

3.5 BRU對RhoA/ROCK1通路相關蛋白表達的影響用不同濃度的BRU(0、3、6 nmol·L-1)處理HCT-116細胞24 h后，Western blot檢測結果顯示，與對照組(即0 nmol·L-1BRU處理組)相比，經BRU處理后的加藥組中的RhoA、ROCK1蛋白的相對表達量均明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果提示BRU可以抑制RhoA、ROCK1蛋白的表達，見Fig5。

Fig 4 Effect of BRU on expression of MMP2,MMP9 protein in HCT-116 cells n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs Control

Fig 5 Effect of BRU on expression of RhoA,ROCK1 protein in HCT-116 cells n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs Control

3.6 BRU和Y27632對ROCK通路相關蛋白表達的影響用BRU(6 nmol·L-1)和ROCK抑制劑分別處理HCT-116細胞，再用BRU和Y27632共同處理HCT-116細胞后，將細胞收集進行Western blot檢測。結果顯示，與對照組相比，經BRU或Y27632處理后的加藥組中的RhoA、ROCK1、MMP2和MMP9蛋白的相對表達量均減少，經BRU和Y27632共同處理后的HCT-116細胞中RhoA、ROCK1、MMP2和MMP9蛋白表達量減少更為明顯，差異具有統計學意義(P<0.01)。結果提示BRU和Y27632一樣，都能抑制ROCK通路相關蛋白的表達，見Fig6。

Fig 6 Effect of BRU and Y27632 on expression of ROCK signaling pathway related proteins in HCT-116 cells n=3)**P<0.01 vs Control

4 討論

結直腸癌(CRC)是全球第三大最常見的惡性腫瘤，也是全球第四大癌癥相關的死亡原因。結直腸癌是一種多因素的疾病，與遺傳、環境和生活方式等多種危險因素有關[8]。目前結直腸癌的預后仍然較差，約50%的患者在手術后2年內死亡[9]。中醫學里無結直腸癌的說法，從其發病的特征和臨床表現分析，通常將其歸于“腸積”、“腸風”、“臟毒”等病的范疇。中醫認為外感濕熱或脾胃損傷導致水濕內生，郁久化熱，是結直腸癌發病的重要原因。本病的主要病因是濕熱，故以清熱利濕、化瘀解毒為治療原則[10]。長期以來，人們一直在研究中草藥的天然產品作為癌癥治療的潛力藥物。研究中藥對結直腸癌的治療或許將是提高其預后的新思路。

鴉膽子作為一種常用中藥,性苦味寒，入大腸經、肝經，具有清熱、燥濕、解毒、殺蟲、止痢的作用,是一種非常有開發價值的藥物。鴉膽子苦醇(BRU)是一種從鴉膽子籽中提取的類黃酮類化合物，最近的研究證明，BRU可以抑制肺癌細胞Nrf2信號通路，從而抑制肺癌細胞的抗氧化功能，增加放化療造成的DNA損傷，提高化療藥物的療效[11]。同時，Nrf2作為維持氧化還原穩態的關鍵調節因子，已被證明與癌癥的侵襲性增殖等惡性表型有關[12]。因此，作為Nrf2的特效抑制劑，BRU在多種癌癥中的腫瘤抑制作用越來越受到重視。臨床試驗表明，BRU可有效抑制胰腺癌、肝癌、前列腺癌等癌細胞的增殖,是潛在的天然抗腫瘤藥物[13]。但其對結腸癌的影響還未見報道。因此，本文旨在研究BRU對結腸癌遷移和侵襲的影響和作用機制。

本研究采用CCK-8法檢測了BRU對HCT-116細胞的增殖抑制作用，結果表明HCT-116細胞的增殖能被BRU顯著抑制，且呈濃度和時間依賴性。選取BRU對HCT-116細胞24 h的IC10作為最大加藥濃度,進一步探究BRU對HCT-116細胞遷移和侵襲的影響。通過劃痕實驗和Transwell實驗的結果顯示較低濃度的BRU就可以顯著抑制結直腸癌細胞HCT-116的遷移和侵襲,且呈濃度依賴性。

腫瘤的轉移是涉及肌動蛋白結構的動態形成和分解引發的多因素和多細胞過程[14]。這些過程又涉及Rho亞家族(RhoA、RhoC)，活化的RhoA通常調節肌動蛋白應激纖維的形成并影響肌動球蛋白的收縮性。RhoA的下游因子是Rho相關的卷曲螺旋激酶1(ROCK1)，活化的RhoA激活ROCK1，使肌球蛋白磷酸酶磷酸化而失活，導致磷酸化的肌球蛋白不能脫磷酸化，使得胞質內磷酸化的肌球蛋白水平增加，增加肌動蛋白與肌球蛋白的相互作用,引起細胞的黏附、侵襲和遷移[15]。大量研究發現，RhoA/ROCK1信號通路在細胞遷移時能調節細胞的黏附、形態變化和細胞骨架拉伸，這對癌癥轉移具有重要影響。RhoA的激活可以促進結直腸癌細胞的增殖和轉移，而靶向RhoA/ROCK1信號通路是抑制結直腸癌轉移的可行方法。在本實驗中，用不同濃度BRU處理結腸癌細胞HCT-116后RhoA和 ROCK1的蛋白水平明顯下調。提示BRU可能通過RhoA/ROCK1信號通路抑制結腸癌細胞HCT-116的遷移和侵襲。

基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類活性上依賴鈣離子和鋅離子的蛋白水解酶,它能降解細胞外基質和細胞基底膜，從而導致細胞局部缺損[16]。由于MMPs的表達對于腫瘤轉移表現出較強的相關性，在過表達MMPs的結直腸癌細胞中，其遷移與侵襲能力增強,所以抑制MMPs的表達可能是治療結直腸癌的潛在有效方式[17]。以往的研究表明，ROCK抑制劑Y27632可以抑制HCC的進展和肝內轉移，這可能與腫瘤細胞中MMP2、MMP9表達的降低有關。除了遷移的影響外，ROCK在腫瘤的發生和發展的大多數步驟中都起著作用，包括增殖、侵襲和轉移。RhoA/ROCK在膠質母細胞瘤中的表達增加，并與腫瘤細胞的惡性程度呈正相關，ROCK參與了MMPs的調控，MMP2的表達可以被ROCK抑制劑法舒地爾所抑制[18]，提示MMPs是RhoA/ROCK1信號通路的下游。本研究中，經BRU處理后的HCT-116細胞中的RhoA、ROCK1、MMP2和MMP9蛋白水平下調，與Y27632處理后的結果一致，提示BRU可能是一種潛在的RhoA/ROCK通路抑制劑，能夠通過RhoA/ROCK1信號通路抑制MMP2和MMP9蛋白的表達，進而抑制HCT-116細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，BRU可能通過RhoA/ROCK1信號通路抑制結腸癌細胞HCT-116的遷移和侵襲。提示BRU對結腸癌細胞HCT-116有良好的抗腫瘤活性，是一種治療結腸癌的潛在有效藥物，RhoA/ROCK1信號通路是一個治療結直腸癌的有前景的靶點，對其作用機制的進一步研究有助于發現BRU潛在的藥理作用。