RNA結合基序蛋白25作用的研究進展

趙可心，丁 虹，劉 述，張小衛

(蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730000)

RNA結合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)通常被認為是通過一個或多個球狀RNA結合域(RNA-binding domain)結合RNA并改變結合RNA結構或功能的蛋白質。RBPs在RNA加工和代謝中起著至關重要的作用，包括mRNA前體剪接，聚腺苷酸化，mRNA定位、轉運和翻譯，mRNA穩定性控制和各種類型RNA的編輯[1]。這些年來，已經發現并研究了數百種類似的RBPs。RBM25則屬于RBPs家族的一員，是一種新型的全局性剪接因子。已有大量研究表明RBM25與多種疾病相關，包括心血管疾病與腫瘤，但關于RBM25的系統研究并不多。本文將主要對RNA結合基序蛋白25的基本結構和功能、調控作用機制與研究進展進行綜述。

1 RBM25的基本結構與功能

1.1 RBM25的基本結構RBM25在真核生物細胞譜系中的表達廣泛且較為保守，它含有843個氨基酸，由3個蛋白質結構域組成：①與RNA結合的N末端有一個富含脯氨酸的結構域(P)和RNA識別基序(RNA recognition motif，RRM)結構域，②富含精氨酸和谷氨酰胺/精氨酸和天門冬酰胺二肽重復序列構(rich in arginine and glutamine/arginine and asparagine dipeptide repeats，RE/RD-rich)的中央結構域，③與RNA結合的C末端的脯氨酸-色氨酸-異亮氨酸結構域(the proline-tryptophan-isoleucine domain，PWI)結構域[2]。

RBPs成員擁有共同的RD/RE-rich結構域及PWI結構域。RD/RE-rich結構域有利于將RBM25定位于富含剪接因子的核小體周圍，并與剪接因子如SRm160/300、UsnRNAs相互作用組裝剪接體復合物并調控剪接[2]；而且，這種富含RD/RE的基序對于構建和選擇性剪接所需的蛋白質-蛋白質相互作用的形成是非常重要的[3]。晶體結構解析顯示，PWI結構域的結構主要是由一個高度保守的四股螺旋束組成，它是一類具有結合DNA和RNA 雙重能力的新型核酸結合結構域，對單鏈和雙鏈的核酸均具有相似的親和力[4]。

1.2 RBM25的功能選擇性剪接是基因表達的普遍調節機制，其允許從單個基因產生一個以上的獨特mRNA種類，從而產生許多蛋白質異構體，通常具有不同的生物功能。

RBM25是公認的在整個真核細胞系中都高度保守的剪接因子[4]。高通量測序顯示，RBM25促進了整個人類基因組中至少20%的選擇性剪接[5]。同時，人們對剪接事件的轉錄組范圍分析表明，RBM25不僅調節了整個人類基因組中大部分外顯子的剪接，它還通過充當pre-mRNA剪接的調節劑來影響總體轉錄水平，從而影響更為廣泛的基因表達程序，進而影響細胞代謝中涉及的途徑。而且，RBM25 還可以作為剪接因子通過與剪接過程中外顯子識別相關的因子相互作用，即RBM25與富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子2(serine and arginine rich splicing factor 2，SRSF2)的RS區域特異結合能夠促進選擇性弱持續外顯子的剪接保留。此外，對蛋白質組學分析表明，RBM25通過其各個蛋白質結構域與剪接體的核心元件以及替代剪接調節劑相互作用[5]。以上這些結果均說明RBM25是一個全方位性的可變剪接因子。

2 RBM25的調控作用機制

2.1 RBM25與snRNP和LUC7L3RBM25是一個調控Pre-mRNA剪接的剪接因子，mRNA前體的剪接發生在剪接體中，該剪接體通過添加小核糖核核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins，snRNP)顆粒和許多輔助的非snRNP剪接因子進行逐步組裝，而內含子的切除和外顯子的結合取決于剪接機制對5′剪接位點(5′ss)和3′剪接位點(3′ss)的識別和使用[6]。在mRNA前體剪接的早期，內含子的5′ss序列被核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)及其相關蛋白結合，形成U1 snRNP[7]；想要形成一個完整組裝的剪接體，U1 snRNA堿基配對識別5′ss并被U1 snRNP穩定是這個過程中至關重要的一環。

Fig 1 Schematic diagram of RNA-binding motif protein 25P:The N-terminal bound to RNA has a proline-rich domain;RRM:RNA recognition motif domain;RE/RD-rich:rich in arginine and glutamine/arginine and asparagine dipeptide repeats;PWI:the proline-tryptophan-isoleucine domain binding to the C-terminal of RNA.

LUC7L3(LUC7 like 3 pre-mRNA splicing factor)被稱為對酸中毒和缺氧敏感的剪接因子，是酵母U1 snRNP的相關因子。LUC7L3具有兩個鋅指結構：第一個鋅指結構交聯pre-mRNA，是LUC7L3剪接活性所必需的；LUC7L3可通過其第二個鋅指結構充當pre-mRNA和U1 snRNP之間的橋梁。RBM25與LUC7L3的人類同源物選擇性相關，并且RBM25的作用是由LUC7L3介導的，RBM25選擇性地與LUC7L3結合，并通過與外顯子剪接順式元件CGGGCA的相互作用穩定Pre-mRNA-U1 snRNP，從而激活5′ss，最終完成剪接過程[8]。

2.2 RBM25與SCN5ASCN5A是編碼心臟鈉通道(Nav1.5)的α亞基，該亞基負責產生激發在心肌細胞中傳播正常的內向鈉電流(INa)功能[9]。掃描整個SCN5A mRNA序列顯示：在檢測到SCN5A剪接變異體的地方，只有一個RBM25的單一結合位點；并且發現剪接因子RBM25的順式元件CGGGCA在SCN5A變體E28C和E28D的剪接位點附近。通過凝膠遷移率遷移分析表明：RMB25與SCN5A第28外顯子的規范序列CGGGCA特異性結合，導致SCN5A mRNA異常剪接，產生E28C和E28D兩個截短的轉錄物變體，從而激活了UPR(未折疊蛋白反應)，并且這種激活進一步降低了SCN5A的全長mRNA轉錄豐度，全長SCN5A mRNA和蛋白質減少，從而導致Na+電流減少。證實了剪接調節因子RMB25的上調與下調是引起SCN5A mRNA異常剪接的必要條件[10]。

2.3 RBM25與Bcl-2眾所周知，程序性細胞死亡(稱為凋亡)在發育和疾病的細胞穩態中發揮至關重要的作用。B淋巴細胞瘤(B-cell lymphoma，Bcl)蛋白可以是促凋亡的，也可以是抗凋亡的，這具體取決于Bcl-2同源性(BCL-2 homology，BH)結構域的存在[11]。Bcl-2家族成員Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bcl-x)是具有多個BH結構域的一種線粒體跨膜蛋白，它可以調節線粒體外膜通透性并響應于不同的刺激后將細胞色素C釋放到細胞質中，具有調節內在凋亡通路的功能[12]。Bcl-x基因由3個外顯子組成，其中，Bcl-x外顯子2的可變剪接事件產生了兩種拮抗細胞存活的Bcl-x亞型：抗凋亡的長亞型(Bcl-xL)和促凋亡的短亞型(Bcl-xS)，有多種剪接因子和信號通路會影響Bcl-xL /Bcl-xS剪接比，包括富含絲氨酸/精氨酸的蛋白質，異質核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs)，轉錄因子和細胞因子[13]。

有研究表明，RBM25表達增加與細胞凋亡增加相關。RBM25通過與位于外顯子2內的CGGGCA序列與Bcl-x RNA特異性結合，并以劑量依賴的方式促進促凋亡Bcl-xS 5′ss的選擇能力，導致Bcl-xS與Bcl-xL的比率增加，最終促進細胞發生凋亡[11]。

2.4 RBM25與p53和circAMOTL1L-miR-193a-5p-Pcdha通路p53蛋白(protein p53,p53)，環狀RNA(circular RNA，circRNA)和微小RNA(micro RNA，miRNA)是激活癌癥轉移中上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)程序的調控網絡的重要組成部分。研究顯示，人類前列腺癌(prostatic cancer，PCa)中類血管動蛋白1(angiomotin like 1，Amotl1)衍生的circRNA被稱為circAMOTL1L，而circAMOTL1L的降低通過下調E-鈣黏著蛋白和上調波形蛋白促進PCa細胞的遷移和侵襲，從而導致EMT和PCa的發展，而circAMOTL1L充當海綿結合PCa細胞中的miR-193a-5p，從而減輕了對Pcdha的miR-193a-5p的抑制基因簇(鈣粘蛋白超家族成員的子集)，因此由circAMOTL1L下調介導的circAMOTL1L-miR-193a-5p-Pcdha調節途徑的失調有助于體內PCa的生長。此外，該研究表明RBM25能夠直接綁定到circAMOTL1L并誘導其生物發生，而p53則通過RBM25基因的直接激活來調節EMT[14]。

3 RBM25在心血管疾病中的研究進展

3.1 RBM25與心力衰竭心血管疾病(cardiovascular diseases，CVDs)發病率高,治愈率低,死亡率大,現已成為嚴重威脅人類健康疾病[15]。心力衰竭(heart failure，HF)是心血管疾病中一種常見的、進展性的、復雜的臨床綜合征，是一個嚴重的公共衛生問題，并且是全球范圍內死亡的主要原因，給社會和個人帶來了極大的健康威脅和經濟負擔。然而，導致HF發病率和死亡率高的主要原因之一是與之相關的心律失常[16]。

電壓門控鈉通道負責可興奮細胞(如神經元、肌肉和肌細胞)中動作電位的起始和傳播。心臟鈉離子通道通過響應膜去極化而迅速激活，并通過膜向內傳導鈉離子，從而產生心臟動作電位的上升,動作電位上升的速率依賴于電壓門控鈉通道的快速激活，控制著動作電位通過心臟組織傳播的速率和均勻性[17]。電壓門控NaV1.5是心肌細胞表達的主要鈉通道，突變或病理生理條件導致的NaV1.5功能障礙會導致危及生命的心律失常[18]。SCN5A編碼的鈉通道的活性決定了心臟的去極化和電傳導，而編碼傳導Na+電流(INa+)的離子通道的SCN5A基因突變可能導致心律失常[9]。SCN5A的遺傳變異與許多遺傳性心臟通道疾病有關，包括Brugada綜合征(BrS)、長QT綜合征(LQT3)和心臟傳導系統功能障礙[9]。在一個小鼠模型中，SCN5A基因的一個等位基因被截斷變異體所取代導致胚胎致死，顯示心臟Na+電流減少大于80%，胞胚胎干細胞來源的心肌細胞傳導速度顯著降低[12]，這表明SCN5A即使是細微的變化也可能導致心臟病的發生。

選擇性剪接在心臟代償性反應中起主要作用,剪接因子序列的改變或突變引起基因產物的錯誤剪接,是導致多種人類疾病的根本原因[19]。有文獻表明，剪接因子RBM25的順式元件CGGGCA在SCN5A變體E28C和E28D的剪接位點附近，并通過qRT-PCR在人HF組織中證實了剪接因子RBM25和LUC7L3的上調。與正常人心臟組織相比，在心衰組織中RBM25和LUC7L3表達分別增高了1.1和0.6倍，而全長SCN5A的mRNA和蛋白的表達降低了0.6倍。為了進一步探索RBM25調控可變剪接的內在機制，該研究小組發現：AngⅡ(血管緊張素2)和缺氧是HF常見的上游信號，可導致LUC7L3和RBM25增加，進而導致RBM25與SCN5A mRNA的結合增加，SCN5A mRNA發生異常剪接，SCN5A剪接變異體增加，產生兩個轉錄物變異體(E28C和E28D)，這兩個變異體編碼在結構域Ⅳ成孔段之前被截斷的心臟Na+通道，從而激活了UPR，并且這種激活進一步降低了全長SCN5A的mRNA轉錄豐度，全長SCN5A mRNA和蛋白質減少，從而導致Na+電流減少[10]。

總而言之，HF與Pre-mRNA剪接因子的失調有關，其中剪接因子RBM25/LUC7L3復合物介導異常SCN5A mRNA的調控，進而導致變異的鈉通道不能發揮正常的生理作用，從而導致電流減少引起心律失常，最終引發HF。

3.2 RBM25與心肌病心肌病是異質性的心肌病變，表現為心肌結構和功能的異常，心肌病最終會導致HF甚至死亡。導致持續性室性快速心律失常的肥厚型心肌病(HCM)是年輕患者猝死的最常見原因[16]。有研究者測試了肥厚型心肌病(HCM)中SCN5A的轉錄后調控，結果發現：① HCM中的剪接因子RBM25和Luc7A被上調；② HCM中心臟Na+通道SCN5A pre-mRNA存在異常剪接，變異體E28C和E28D的表達水平顯著增加；③ HCM中的UPR(未折疊蛋白反應)成分PERK(蛋白激酶RNA樣內質網激酶)被上調。這表明了人類HCM鈉通道全長mRNA的減少部分是由于異常的SCN5A mRNA剪接和UPR的激活所致，而SCN5A的減少可能會導致HCM患者的心律失常風險[20]。與此同時，剪接調節因子RMB25的上調與下調又是引起SCN5A mRNA異常剪接的必要條件。

4 RBM25在腫瘤中的研究進展

4.1 RBM25與結腸直癌結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是威脅人們生命健康的主要癌癥之一，造成了嚴重的社會負擔。預計到2030年，全球CRC的負擔將增加60%，達到220萬新發病例和110萬死亡病例[21]。左側和右側結腸癌(LC、RC)的分子特征和預后差異很大，因此需要使用不同的策略進行治療。有研究小組分析了DESF(差異表達的剪接因子)與DEAS(差異表達的可變剪接)之間的相關性，并對顯著相關的區域構建了一個相關網絡。結果發現RBM25是相關網絡中的樞紐SF(剪接因子)，并且與218個DEAS中的121個顯著相關，這表明了RBM25是LC和RC中不同可變剪接事件的關鍵決定因素。接著，該研究小組又分析了RBM25在結腸癌中的臨床意義，發現結腸癌組織中RBM25的表達明顯高于鄰近組織。但是，生存分析表明，RBM25高表達和低表達的患者的總生存率無明顯差異[22]。

隨后有研究小組通過蛋白質組分析揭示了RBM25是結直腸癌的腫瘤生物標志物[23]。

4.2 RBM25與前列腺癌PCa是全世界男性中最常見的癌癥之一。PCa轉移與EMT過程密切相關，這一過程可使上皮細胞喪失粘附相鄰細胞和細胞外基質蛋白并獲得間質表型的能力[24]。p53、cirRNA和miRNA是激活癌癥轉移中EMT程序的調控網絡的重要組成部分。有研究顯示，人類PCa中Amotl1衍生的circAMOTL1L被下調，而降低的circAMOTL1L通過下調E-鈣黏著蛋白和增加波形蛋白表達促進PCa細胞遷移和侵襲，從而導致EMT和PCa進程。在這個進程中RBM25負責直接與circAMOTL1L結合并誘導其生物發生，而p53則通過RBM25介導circAMOTL1L來調節EMT相關基因的表達[14]。

4.3 RBM25與急性髓細胞性白血病急性髓細胞性白血病(acute myeloic leukemia，AML)是一種侵襲性血液病，AML構成了一種發展停滯狀態，其中類似于正常髓系祖細胞的白血病母細胞無法分化，因此在骨髓和周圍器官中積累。最近的癌癥基因組測序研究揭示了包括AML在內的許多癌癥的遺傳學，發現除了編碼表觀遺傳調控因子、轉錄因子和生長調控因子的基因外，剪接因子基因經常在人AML中發生突變[25]。

最近有研究小組為尋找AML中潛在的剪接調節劑中的新型腫瘤抑制因子和致癌基因做了一系列相關實驗。結果發現：RBM25作為潛在的腫瘤抑制因子，它的損失不僅導致大量白血病細胞而且使具有白血病干細胞器特性的細胞的凋亡減少以及增殖增加，最終促進了白血病的發生。從分子上講，RBM25控制許多關鍵的Pre-mRNA的剪接，包括編碼凋亡調節因子BCL-X和癌基因MYC抑制劑BIN1。RBM25通過抑制BIN1(+12)亞型的表達來限制癌基因MYC活性，從而控制癌基因MYC轉錄活性,最終起到抑癌的作用[26]。

5 討論與展望

綜上所述，RBM25作為一個新型全方位性剪切因子，對mRNA剪接體的可變剪接和組裝的調控過程起著重要作用。RBM25參與細胞凋亡、離子通道電流、細胞因子活性改變過程中關鍵基因的剪接，與心血管疾病與腫瘤的發生與發展密切相關。RBM25在心力衰竭、心肌病和不同種類癌癥中表達升高，提示RBM25可能是臨床診斷中潛在的生物標志物。

在HF中，充血性HF為最終的結局，其特征為心肌細胞凋亡、炎癥和瘢痕形成，最終導致心肌收縮力喪失，而心肌細胞凋亡在其中起著關鍵的作用。這表明，心肌細胞凋亡可能是HF發生的直接原因。已有文獻表明：在心衰組織中發現RBM25高表達；同時也有文獻表明：RBM25通過調節HeLa細胞中的BCL-X亞型的比例來促進細胞發生凋亡。然而，并未有研究闡明RBM25在HF發生與發展過程是否對心肌細胞凋亡產生影響。所以探尋RBM25介導的Pre-mRNA可變剪接在心力衰竭中引起心肌細胞凋亡的分子機制,將為臨床治療HF患者提供有效治療的靶點。

RBM25在不同種類癌癥中表達升高，在體外和體內繼續研究 RBM25在致癌或抑癌中的更多調控機制十分重要。RBM25作為一種生物信號，不斷深入研究其參與的信號通路與轉導途徑，有利于提高醫療水平的精準化。