RNA m5C甲基化在腫瘤發生發展中的調控作用

徐英杰，文雪倩，馮璐瑤，田 鑫

(鄭州大學第一附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450052)

RNA轉錄后修飾作為表觀遺傳領域研究的前沿和熱點，近年來受到了越來越多的關注。目前發現的170多種RNA轉錄后修飾中，2/3為甲基化修飾，包括m1A、m6A、m5C和m7G等。RNA的5-甲基胞嘧啶(m5C)甲基化修飾是指RNA胞嘧啶上第五位碳原子上發生甲基化，于上世紀70年代在rRNA中發現，后來相繼在轉運RNA(tRNA),信使RNA(mRNA),和長鏈非編碼RNA(lncRNA)上發現[1]。RNA的m5C修飾在細胞中廣泛存在，且對基因的表達、RNA的穩定性等起著重要的調控作用。此外m5C甲基化和原癌基因的激活有密切聯系，m5C修飾的甲基轉移酶NSUN2等在腫瘤組織和癌旁組織中存在差異表達。本文綜述了m5C甲基化在各種類型RNA中的分布和功能，并介紹了m5C甲基化在腫瘤發生發展中的作用。

1 m5C甲基化修飾，見Fig1。

Fig 1 The dynamic regulation of m5C in RNA and function of regulating mRNA export

RNA的m5C甲基化修飾受到甲基化轉移酶和去甲基化轉移酶的動態調控，在甲基化轉移酶的催化作用下，RNA發生m5C修飾，而后與識別蛋白相結合發揮出特定的生物學功能[1]。m5C修飾主要的甲基轉移酶包括NSUN1、NSUN2、NSUN3、NSUN4、NSUN5和NSUN7，以及DNMT2，其共有的特點是結構上都具有一個保守的半胱氨酸殘基，能夠在甲基化供體S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的幫助下催化各種類型的RNA發生m5C甲基化修飾[2]。

1.1 甲基化轉移酶NSUN家族蛋白是近年來研究較為廣泛的m5C甲基轉移酶。人的NSUN家族蛋白共有七個成員，都具有m5C甲基轉移功能結構域，并含有兩個催化甲基轉移功能所必須的半胱氨酸。NSUN家族催化甲基轉移的共有機制為首先在甲基化轉移酶的半胱氨酸和RNA的胞嘧啶之間發生共價結合形成共價中間體，然后富電子的胞嘧啶環對SAM上的甲基發生親核加成，最終完成甲基化。

NSUN1主要定位于細胞核中，早期研究發現NSUN1在酵母中主要催化25s rRNA的C2870位點發生m5C甲基化，并且在功能上影響60s rRNA的成熟。最近有研究表明，NSUN1可以競爭結合HIV-1病毒的Tar RNA，并催化其發生m5C甲基化最終抑制病毒DNA的轉錄[3]。

NSUN家族中研究最為廣泛的是NSUN2，NSUN2主要定位在細胞核中，在胚胎發育細胞分化及腫瘤發生中發揮重要作用。現在已有證據表明NSUN2可以催化多種類型的RNA發生m5C甲基化，包括tRNA、mRNA和非編碼RNA。在生物學功能方面也有研究表明NSUN2在小鼠胚胎的發育和細胞的分化過程也發揮著重要的調控作用，例如NSUN2在小鼠胚胎中發生缺失會導致小鼠發育遲緩和組織分化缺陷。NSUN2還可以催化HIV病毒轉錄本發生m5C甲基化，敲除NSUN2會影響HIV病毒轉錄本的可變剪切，進而抑制HIV病毒轉錄本的翻譯，說明m5C甲基化不僅在胚胎發育中發揮著調控作用，在病毒的生命周期中也發揮著重要的調控作用[2，4]。

NSUN3主要定位于線粒體中，特異性催化線粒體tRNA的C34位胞嘧啶發生m5C甲基化。已有研究表明NSUN3缺失導致tRNA上甲基化減少，導致蛋白質的翻譯過程受阻。也有證據表明小鼠胚胎干細胞中的NSUN3缺失會導致胚胎干細胞分化成為神經外胚層的能力受損。在人體中有研究表明線粒體呼吸鏈復合物缺陷患者中廣泛存在NSUN3突變，這直接導致線粒體tRNA上的C34缺乏m5C修飾最終導致線粒體翻譯功能受損[5]。

NSUN4和NSUN5均為rRNA特異性的m5C甲基轉移酶，其中NSUN4定位于線粒體中，由NSUN4和NSUN5介導的rRNA上的m5C甲基化均和rRNA的組裝和成熟有關。且NSUN4還可以和Mterf4形成復合物參與線粒體中核糖體大小亞基的組裝過程，直接影響rRNA的成熟。NSUN5與神經系統的發育有關，有研究表明NSUN5敲除的小鼠會發生神經系統發育異常，表現為空間認知障礙[2]。

NSUN6為tRNA特異性甲基轉移酶，定位于細胞質中，其功能和tRNA的剪切成熟相關。在腫瘤中，有研究報道NSUN6在睪丸癌、甲狀腺癌、肝癌和卵巢癌中表達降低，低表達NSUN6往往提示預后較差。此外，還有研究報道NSUN6可以和LLGL2以及lncRNA MAYA形成復合物，催化Hippo信號通路中的核心蛋白MST1發生甲基化進而破壞其激酶活性，最終導致原癌基因YAP被激活并積聚在核內以促進與腫瘤細胞增殖和骨轉移有關的靶基因表達[6]。

NSUN7在細胞中主要定位于細胞核，在維持精子的正常功能中發揮重要作用，成年雄性小鼠的NSUN7發生突變會導致精子活力受損和不育。此外，NSUN7可以催化與轉錄因子PGC-1α相互作用的eRNA發生m5C甲基化，敲低NSUN7會導致PGC-1α靶基因相關eRNA含量減少，進而導致靶基因表達量減少[7]。

Dnmt2是一種tRNA和mi-RNA的甲基轉移酶，主要位于細胞核中。Dnmt2可以催化tRNA上C38位發生m5C修飾，在NSUN2和Dnmt2雙敲除小鼠中可以觀察到tRNA上缺失m5C修飾，進而導致tRNA穩定性和蛋白翻譯速率的下降。在成纖維細胞中敲低Dnmt2導致細胞增殖相關的miR-28-3p、miR-34a-3p上調，會使細胞更容易受到氧化應激和DNA損傷。有研究表明Dnmt2敲除會導致斑馬魚視網膜、肝和腦分化缺陷，在小鼠中敲除Dnmt2會導致小鼠軟骨內骨化、心肌肥厚和造血系統分化缺陷，表明Dnmt2介導的m5C甲基化和細胞的分化以及組織的發育過程密切相關[8]。

1.2 m5C去甲基化酶目前對于DNA的去甲基化過程和去甲基酶TET家族已經有了比較清楚的認識，主要機制為TET在α酮戊二酸和二價鐵離子的的協同作用下催化DNA上的5-mC甲基發生去甲基化，同時在這個過程中還會產生5-hmC、5-ac等中間產物。最近有研究發現在小鼠胚胎干細胞中敲除TET2會導致tRNA上的hm5C水平顯著降低，而過表達TET2則會導致tRNA上的hm5C水平升高，m5C水平降低，同時體外研究發現TET2催化tRNA上的m5C修飾發生氧化還會促進翻譯過程[9]。

還有研究表明，m1A的去甲基酶ALKBH1可以催化線粒體tRNA上C34位的m5C修飾發生羥基化轉化為hm5C，再氧化為f5C。在293T細胞中敲除ALKBH1可以導致線粒體tRNA上f5C修飾減少，進而導致線粒體翻譯功能和呼吸功能受損[10]。說明ALKBH1介導的m5C去甲基化作用在維持線粒體正常功能中發揮重要作用。

1.3 m5C識別蛋白已經報道的m5C甲基化識別蛋白主要包括調控出核的ALYREF、參與DNA損傷修復的RAD52以及調控RNA穩定性的YBX1[11]。ALYREF作為m5C甲基化的識別蛋白，可以在細胞核內與具有m5C修飾的mRNA特異性結合形成mRNPs復合體促進mRNA的出核，在ALYREF敲減的細胞系中，具有m5C修飾的mRNA在細胞核內聚集，而這種聚集只能被回補野生型的ALYREF所取消，回補突變型的ALYREF則不發生改變，進一步驗證了ALYREF通過識別和結合具有m5C修飾的mRNA發揮其促進mRNA出核的功能[11]。另有研究報道YBX1作為另一種m5C甲基化修飾的識別蛋白，可以在斑馬魚早期胚胎發育過程中的母源-合子轉換期特異的結合具有m5C修飾的mRNA并維持其穩定性[12]。

此外有研究表明m5C甲基轉移酶DNMT2可以特異性催化位于DNA損傷位點處的RNA發生m5C修飾。而RAD52作為m5C修飾的識別蛋白和DNA損傷位點的m5C修飾特異性的結合，從而參與后續的同源重組修復過程。進一步的研究發現，m5C在同源重組修復中的作用和腫瘤細胞對放射療法和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑(PARPi)療法的敏感性有關，伴隨DNMT2丟失的同源重組缺陷型腫瘤對PARP抑制劑較為敏感[13]。上述研究表明m5C修飾在RNA出核、早期胚胎發育、DNA損傷修復等多種生物學過程中發揮重要作用。

2 m5C甲基化在腫瘤發生發展中的作用

近年來越來越多的研究表明，m5C甲基化及其修飾酶在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要的作用。由于技術的限制，早期的大多數的研究集中在和m5C甲基化相關的修飾蛋白在腫瘤的發生發展中發揮的作用。例如m5C甲基轉移酶NSUN2在乳腺癌、結直腸癌等多種腫瘤中高表達，且和預后有密切聯系。而近年來的研究則更多的集中在特定位點的m5C修飾在腫瘤發生過程中發揮的作用。

2.1 m5C甲基化在膀胱癌發生發展中的作用在膀胱癌中，相較于癌旁組織，癌組織中m5C甲基轉移酶NSUN2和m5C識別蛋白YBX1高表達，使得癌基因HDGF上m5C甲基化修飾水平升高，而YBX1可以特異性識別HDGF mRNA上具有m5C修飾的位點并招募ELAVL1發揮其維持mRNA穩定性的功能，最終使得原癌基因HDGF穩定高表達。臨床數據也證明了NSUN2、YBX1和HDGF高表達的患者具有較差的預后，說明了由NSUN2介導的m5C甲基化在膀胱癌中起到了促進腫瘤發生和進展的作用[4]。

2.2 m5C甲基化在皮膚鱗狀細胞癌起始細胞中的作用

在皮膚鱗狀細胞癌中，NSUN2被發現在腫瘤起始細胞(tumour-initiating cells)中相較于高分化腫瘤細胞低表達，此外還發現在腫瘤起始細胞中，蛋白合成速率較低，這與之前關于腫瘤干細胞的報道是一致的。進一步研究發現蛋白合成速率的降低可能是由NSUN2低表達導致tRNA上的m5C甲基化發生缺失，最終使腫瘤起始細胞具有一定的干細胞特性，說明m5C甲基化對維持腫瘤細胞的干細胞特性發揮著重要作用[14-15]。

2.3 m5C甲基化在神經膠質瘤發生發展中的作用有研究表明NSUN1、NSUN4、NSUN5，NSUN6和NSUN7在正常腦組織和神經膠質瘤中存在差異表達，結合病理分級信息后發現NSUN1和NSUN4在較高級別的神經膠質瘤組織中表達顯著高于低級別神經膠質瘤，且m5C甲基轉移酶表達譜和神經膠質瘤的臨床病理特征以及預后密切相關，表明m5C甲基轉移酶的表達可以作為判斷神經膠質瘤預后的標志[16]。另有研究報道神經膠質瘤中存在由于NSUN5基因啟動子區域的CpG島區域高甲基化而導致的轉錄沉默，且這種轉錄沉默和膠質瘤患者的預后呈現一定相關性。進一步研究發現NSUN5作為28s rRNA上C3782位點的的m5C甲基轉移酶，其轉錄沉默會導致該位點的m5C甲基化發生缺失，進而導致rRNA的構象發生改變，最終使得整體蛋白翻譯水平的下調，氧化應激相關的醌氧化還原酶1(Nqo1)翻譯水平上調，說明m5C甲基化和腫瘤細胞在壓力應激條件下的生存密切相關[17]。

2.4 m5C甲基化在肝癌發生發展中的作用在肝癌中發現包括mRNA、microRNA、lncRNA等多種類型RNA上的m5C修飾在腫瘤的發生發展中發揮重要的調控作用，m5C甲基轉移酶NSUN4，識別蛋白ALYREF等和肝癌的預后密切相關[18]。研究發現相較于癌旁組織，癌組織中H19 lncRNA的表達水平明顯升高，進一步研究發現這是由于NSUN2介導的H19 lncRNA上的m5C修飾可以使H19 lncRNA的穩定性升高。具有m5C修飾的H19 lncRNA可以特異性結合G3BP1蛋白，進一步導致癌蛋白Myc的積累，促進肝癌的發生及發展[19]。

2.5 m5C甲基化在肺癌中的作用在肺腺癌中，有研究報道NSUN1存在高表達，且可以用作判斷預后的標志物[20]。還有研究報道，m5C識別蛋白YBX1的表達量和肺癌細胞對順鉑的敏感性有關，在非小細胞肺癌細胞中敲減YBX1可以通過抑制自噬進而增加細胞對順鉑的敏感性[21]。

2.6 m5C甲基化在胃癌、大腸癌和結直腸癌中的作用有多項研究表明，在胃癌和結直腸癌中，NSUN2存在異常高表達，且和患者的不良預后密切相關[22]。NSUN2的過表達促進了腫瘤細胞的增殖和遷移，而敲減NSUN2則可以抑制這些過程[23]。進一步的研究發現，抑癌基因p57作為NSUN2的下游靶點影響了腫瘤細胞的增殖能力。在細胞中，p57的表達和NSUN2的表達呈負相關，高表達的NSUN2通過催化p57 mRNA的3 ′UTR區域發生 m5C甲基化降低了mRNA的穩定性，抑制了p57的表達，促進腫瘤細胞的增殖[24]。另有研究表明在HeLa細胞系中敲除NSUN2會影響細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性，說明NSUN2可能與腫瘤對藥物的敏感性以及耐藥有關。此外，NSUN5在大腸癌中明顯高表達，研究表明在大腸癌細胞系中敲除NSUN5后會通過抑制細胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)信號傳導造成細胞周期阻滯，顯著抑制細胞增殖[25]。

2.7 m5C甲基化在血液腫瘤中的作用m5C去甲基化酶TET是血液系統惡性腫瘤中的高頻突變基因之一，TET2突變會導致B細胞的發育以及正常的造血功能受損[26]。已有多項研究表明，TET2作為抑癌基因起到腫瘤抑制的作用，TET2敲除的小鼠會出現慢性粒單核細胞白血病和骨髓增生性腫瘤，表明TET2抑制腫瘤中發揮關鍵作用[27]。另有研究報道，在白血病中m5C甲基轉移酶NSUN1通過和BRD4相互作用改變染色質結構從而影響腫瘤細胞對化療藥物5-氮雜胞苷的敏感性[28]。

2.8 小結綜上所述，m5C甲基化及其相關的修飾酶和識別蛋白在腫瘤發生發展過程的多個環節均發揮著重要的調控作用，且一種甲基化轉移酶在不同的腫瘤類型可能發揮著不同的作用。例如，雖然大多數m5C甲基轉移酶在腫瘤中高表達，發揮促進腫瘤細胞增殖的作用[4,20]。但也有m5C修飾酶在腫瘤中低表達，同時伴隨著較差的預后[29]。因此特定位點m5C修飾以及不同的m5C修飾酶在腫瘤中發揮的具體作用仍有待深入研究。

3 展望

目前，對于m5C甲基化在各種RNA中的分布特征以及m5C修飾的生物學功能已經有了初步的認識。因此未來的研究任務主要集中在特定m5C甲基化位點的功能和發現新的識別蛋白，以及m5C修飾在腫瘤等疾病中發揮的具體作用。目前對一些m5C甲基化修飾酶和識別蛋白的蛋白晶體結構以及其與RNA結合的結構域已經有了較為清晰的研究[4]，以m5C甲基化相關修飾酶作為靶點的抑制劑研究已成為關注熱點。此外，已有多項研究表明，m5C相關修飾酶可以作為腫瘤的診斷標志物[18,20,22]，而特定位點的m5C修飾作為腫瘤標志物尚需進一步探索。總之，m5C甲基化在腫瘤發生發展中的調控作用逐漸被揭示，將為腫瘤的診斷和個體化治療提供新的思路。