酶法輔助聚乙二醇-200 提取野菊花中綠原酸的工藝及數學模型分析

劉 霞，方小軍，彭敏娟

（贛南醫學院 藥學院，江西 贛州 341000）

野菊花(Chrysanthemumindicum)為多年生草本植物，多在秋冬時節初開，體輕，氣芳香[1]。具有降壓、保護心血管系統、抗消化性潰瘍、抗病毒等藥理作用[2-4]。

目前關于野菊花中綠原酸的提取研究多集中于不同提取工藝的優化，主要為超聲法[5]、水浴提取法[6]及超聲-微波協同萃取法[7]等。但這些方法不僅成本高、耗時長、溶劑耗量大且提取率低。聚乙二醇（PEG）是一種成本較低、非揮發性且性質比較穩定的環境友好型溶劑[8-9]。纖維素酶能溫和有效地降解植物細胞壁，加速活性成分溶出，從而提高提取效果[10]。采用酶法輔助PEG-200 提取野菊花中綠原酸，并對其綠原酸提取過程進行數學模型的研究尚未見報道。本試驗以野菊花為原材料，采用酶法輔助PEG-200 超聲提取法，用Box- Benhnken 中心組合設計優化提取工藝，并建立了不同液固比下綠原酸提取的數學模型，從而為野菊花資源的進一步開發利用提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野菊花藥材：市售；纖維素酶（5×104u/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；綠原酸對照品：天津一方科技有限公司；其他試劑均為分析純。

SPECORD 50 PLUS 型紫外分光光譜儀：德國耶拿分析儀器股份公司；KQ-500DB 數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Hei-VAP Value Digital G3 旋轉蒸發儀：德祥Tengent；SHA-C 數顯水浴恒溫振蕩器：金壇市白塔新寶儀器廠；PB-10 酸度計：賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

參照文獻[11]綠原酸標準曲線測定方法，精密稱取10.16 mg 綠原酸標準品于100 mL 容量瓶中，并用體積分數為30% PEG-200 溶解稀釋至刻度，即得101.6 μg/mL 的綠原酸標準溶液。分別準確吸取0、0.3、0.6、0.9、1.2 和1.5 mL 上述標準液，用體積分數為30% PEG-200 稀釋并定容至10 mL，即得0、3.12、6.23、9.35、12.47 和15.59 μg/mL系列工作液。在最大吸收波長329 nm 處測定吸光度。以吸光度A329為縱坐標、綠原酸質量濃度C為橫坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程A=0.051C+0.003 9（R2=0.999 8）。

1.2.2 野菊花綠原酸的提取

野菊花→烘干→粉碎→過篩→溶解（體積分數為30%的PEG-200）→調節pH→酶解→超聲提取→趁熱過濾→濾液減壓濃縮→定容

1.2.3 綠原酸提取率測定

將上述提取液按一定比例稀釋后，以 30%PEG-200 為參比，按照1.2.1 的方法測定A 值，并計算綠原酸提取率。

1.2.4 綠原酸提取工藝優化設計

通過單因素試驗考察酶用量、超聲溫度、液固比、酶解溫度及酶解時間對野菊花綠原酸提取率的影響。其中超聲溫度對綠原酸提取率影響不大，擬固定超聲溫度為 50 ℃。利用 Design Expert8.0.6 軟件進行響應面優化試驗方案設計，各因素水平見表1。

1.3 數據分析

響應面優化設計采用Design Expert8.0.6 軟件進行了試驗設計與數據分析，數學模型擬合采用Origin Pro 8.0 數據處理軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶用量對綠原酸提取率的影響

由圖1 可知，在酶用量0%～1.2%時，綠原酸提取率急劇上升；在酶用量為1.2%時綠原酸提取率達到最大值，隨后提取率開始緩緩下降。這是因為隨著酶用量的增加，酶與底物接觸機會增大，酶解反應速率加快；后續增加酶用量，會導致反應系統中底物濃度相對不夠，酶促反應速率下降，因而綠原酸浸出率降低[12]。因此最佳實驗條件選擇纖維素酶用量比例為1.2%。

圖1 酶用量對綠原酸提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on extraction rate of chlorogenic acid

2.1.2 超聲溫度對野菊花綠原酸提取率的影響

由圖2 得知，超聲溫度對野菊花綠原酸提取率的影響是一個先逐步上升后緩慢下降的過程，在超聲溫度為50 ℃時，綠原酸提取率達到最大值3.34%。溫度超過50 ℃后，綠原酸因其結構中的不穩定因素而容易被破壞，如酚羥基易被氧化變成醌，酯鍵容易水解生成羧酸和醇等，致使提取率下降[13]。因此選擇50 ℃為最佳超聲溫度。

2.1.3 液固比對野菊花綠原酸提取率的影響

由圖3 可知，液固比從10∶1 增加15∶1 時，綠原酸提取率增加幅度較明顯。當液固比超過15∶1 時，綠原酸提取率開始逐步下降。這是因為PEG-200 作為非離子型表面活性劑，可明顯降低界面張力，增加細胞膜的滲透性；此外PEG 與水混合后形成膠束，綠原酸的非極性基團可進入膠束內核被增溶，使綠原酸更易溶于水中。而當液固比超過其最佳比后，其他物質也會相應進入膠束內核，占據一定的體積后被增溶[14]，使綠原酸的溶出減少，因此，本試驗的液固比定為15∶1 為宜。

2.1.4 酶解溫度對野菊花綠原酸提取率的影響

由圖4 可知，酶解溫度對野菊花綠原酸提取率的影響是一個呈先上升后下降的趨勢，在酶解溫度為50 ℃時，綠原酸提取率達到最大值。這是因為酶的活力在最適溫度時水解效率最高，低于該溫度，酶活力不足，高于該溫度，酶易變性失活。故本試驗選擇50 ℃為最佳酶解溫度。

圖4 酶解溫度對綠原酸提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of extraction rate of chlorogenic acid

2.1.5 酶解時間對野菊花綠原酸提取率的影響

由圖5 可知，酶解時間在0.5～2 h 之間時，酶解作用時間越長，綠原酸提取率越高，超過2 h后，綠原酸提取率呈下降趨勢。這是因為綠原酸結構具有不穩定性，長時間加熱會導致部分綠原酸水解或者結構異變[15]，因而提取率下降。故本試驗最優酶解時間定為2 h。

圖5 酶解時間對綠原酸提取率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on extraction rate of chlorogenic acid

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析響應面試驗設計方案及結果見表 2。利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2 中的數據進行回歸擬合，得出方差分析表，見表3。

表2 Box-behnken 中心組合試驗結果Table 2 Test results of Box-behnken center combination

表3 響應面方差分析結果Table 3 Variance analysis results of response surface

得到野菊花中綠原酸提取率（Y）對響應值變量A、B、C和D的回歸方程為：

Y=–11.662 8+6.650 8×A+0.148 1×B+0.509 8×C–3.726 3×D–(2.500 0E–003)×A×B–0.035 0×A×C–1.712 5×A×D–(2.500 0E–003)×B×C+0.069 0×B×D+0.125 0×C×D–0.489 1×A2–(4.080 0E–003)×B2–(6.580 0E–003)×C2–0.373 0×D2

由表3 可知，模型的相關系數R2=0.957 6，P＜0.01，表明該模型極顯著。模型校正系數R2Adj=0.915 3，表明方程對實驗擬合良好，可用此數學模型解釋91.53%的野菊花中綠原酸提取率的變異性。一次項A、B、C，交互項AD、BD、CD，二次項A2、B2、C2、D2對試驗結果影響顯著（P＜0.05），表明酶用量、液固比和酶解溫度對野菊花中綠原酸提取率影響顯著，且影響順序（主→次）為液固比＞酶解溫度＞酶用量。

2.2.2 響應面交互作用分析及最佳提取工藝研究

根據表3 可知，交互項AD、BD、CD的P值均小于0.01，表明酶用量與酶解時間、液固比與酶解時間、酶解溫度與酶解時間的交互作用對野菊花中綠原酸提取率的影響達到了極顯著的水平。利用回歸模型作各試驗因素間響應面圖如圖6 所示。

由Design-Expert 8.0.6 軟件進行分析計算得到野菊花綠原酸提取的最佳工藝為：纖維素酶用量0.8%，液固比20∶1(mL∶g)，酶解溫度55 ℃，酶解時間2.5 h，此時野菊花綠原酸提取率的預測值為4.05%。在此工藝條件下進行3 次驗證試驗，實際提取率為3.92%，相對誤差為3.21%，表明該模型合理可靠，具有有效性。

2.3 野菊花中綠原酸提取的數學分析

2.3.1 野菊花中綠原酸提取數學模型的建立

由圖6 可知，液固比對野菊花中綠原酸的提取率有著極其顯著的影響，本試驗固定酶用量為0.8%和酶解溫度為55 ℃，考察不同液固比下綠原酸提取率隨酶解時間的變化規律（圖7）。

圖6 各兩因素交互作用對野菊花綠原酸提取率影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagrams of two factors’ interaction influence on extraction rate of chlorogenic acid from Chrysanthemum indicum

從圖7 中可以看出，液固比過大或過小均不利于綠原酸的提取。液固比過大會導致細胞中其他物質與綠原酸競爭其在膠束中的位置，而液固比過小會導致綠原酸尚未完全溶出就已經飽和，因而影響提取率。

圖7 液固比、酶解時間與綠原酸提取率的關系Fig.7 The relationship between liquid-solid ratio,enzymolysis time and extraction rate of chlorogenic acid

利用OriginPro 8.0 軟件對圖7 的實驗數據進行模型擬合，結果見表4。表4 中的數據表明：除Logostic 模型外，其余三個模型Sgompertz、Asymptotic1 和Slogistic1均能較好的擬合綠原酸提取過程。其中在液固比為10∶1 時，Asymptotic1 模型的Adj-R2為0.951 67，優于其他三個模型；在液固比為15∶1 和20∶1 時，Slogistic1 模型的擬合參數最佳，為最優擬合模型。Slogistic1 模型在液固比10∶1 條件下提取綠原酸的數學模型數據與Asymptotic1 模型相比差別不大。綜合以上數據分析可知Slogistic1 模型更能反映野菊花中綠原酸提取過程的數學規律。

表4 不同液固比下提取模型擬合參數Table 4 Fitting parameters of the extraction model under different liquid-solid ratios

2.3.2 數學模型的驗證

為了驗證模型的正確性，分別在不同液固比條件下選定兩個酶解時間。將實際得到的提取率與預測值進行比較，結果見表5。由表5 可知，實測值與預測值擬合程度高，說明Slogistic1 模型是描述野菊花中綠原酸提取過程的最佳數學模型。

表5 野菊花中綠原酸提取數學模型驗證Table 5 Validation of mathematical model for chlorogenic acid extraction from Chrysanthemum indicum

3 結論

通過響應面分析方法的優化，采用酶法輔助PEG-200 提取野菊花中綠原酸的最佳工藝條件為纖維素酶用量0.8%，液固比20∶1(mL∶g)，酶解溫度55 ℃，酶解時間2.5 h，此時實際提取率為3.92%。對不同液固比下綠原酸提取率隨酶解時間的變化規律采用了4 種數學模型進行擬合，結果顯示：Slogistic1 模型得到最優擬合，是描述野菊花中綠原酸提取過程的最佳數學模型。