平菇病害調查及病原菌分離鑒定*

華 蓉，李建英，劉紹雄，羅孝坤，王小艷，劉春麗，張麗英，孫達鋒**

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省供銷合作社科學研究所，云南 昆明 650221；3.陸良爨鄉綠圓菇業有限公司，云南 曲靖 655601）

平菇 （Pleurotus ostreatus） 中文學名糙皮側耳，又名北風菌、凍菌、蠔菇等，隸屬于擔子菌門 （Basidiomycota） 層菌綱 （Hymenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 側耳科 （Plenrotaceae） 側耳屬（Pleurotus）[1]，其因價格低廉、味道鮮美、營養豐富，深受消費者喜愛。平菇中蛋白質含量高，脂肪含量低，氨基酸含量豐富、種類齊全，膳食纖維、碳水化合物和礦質元素豐富，同時幾丁質多糖、黃酮類、有機酸、多酚等生物活性物質含量較高，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降膽固醇、增強免疫力、護肝、促進大腦發育等多種醫療保健功效[2-7]。

我國是認識平菇最早的國家，南宋時期的陳玉卓在《菌譜》中寫到的“天花蕈”就是平菇[8]。平菇產量高，生產成本較低，售價也相對較低。由于平菇市場需求量大，因此栽培面積較廣，產業發展速度較快，目前已成為我國產量最大的四大食用菌栽培品種之一，也是我國經濟效益較高的食用菌品種，具有較好的產業發展前景[9]。據中國食用菌協會統計，2019年平菇產量686.47萬噸，比2018年增加42.95萬噸[10]。平菇因其栽培技術門檻相對較低，適用的栽培基質較多，栽培規模需求靈活，成為發展“一縣一業”和“一村一品”中的重點栽培品種，也是食用菌產業助推鄉村振興的主要品種。

陸良縣是云南省第一大高原平壩，水資源豐富，屬北亞熱帶冬干夏濕氣候，適合食用菌生長，是云南省的食用菌大縣[11]。陸良縣平菇栽培規模位居全省首位，被中國食用菌協會評為“平菇生產基地”，是云南省綠色食品牌-食用菌產業發展的重點縣，被列為“高原特色食用菌產業大縣”[12-13]。陸良縣平菇產業發展優勢明顯，但目前其平菇產業標準化、自動化生產程度不高，栽培技術規范化不夠，產業技術集成創新不足，菌種生產和管理技術參差不齊，栽培過程中問題較多，且隨著栽培年限增加，病蟲害問題越來越嚴重，制約了平菇產業高質量發展。通過對云南陸良縣平菇栽培過程中病害嚴重地區常見的病害及病原菌進行研究，調查了病害發生的原因，并對病原菌進行分離鑒定，以期能為云南陸良縣平菇栽培管理及病害防治提供理論依據，為平菇菌種選育過程中篩選抗病性強的優良菌株提供供試菌株材料。

1 材料與方法

1.1 平菇病害調查和樣品采集

1.1.1 樣地概況

以云南省平菇栽培產量最大的陸良縣內病害發生情況較為嚴重的地區，作為平菇病害調查地和樣品采集地。具體采樣地點為：馬街鎮趙官壩村（103°44′12.94″E，24°55′46.45″N，海拔 1 818 m），三岔河鎮黃家圩村 （103°43′42.27″E，25°1′36.83″N，海拔 1 804 m），板橋鎮河西堡村 （103°46′24.09″E，25°5′27.47″N，海拔 1 805 m），三岔河鎮三岔子村（103°44′1.50″E，25°2′44.45″N，海拔 1 799 m），小百戶鎮上壩村 （103°35′25.36″E，25°6′34.73″N，海拔1 933 m）。

1.1.2 病害調查和樣品采集

調查時間為2020年9月27日～28日，采集感染雜菌的平菇菌包。詳細記錄樣品采集地平菇栽培情況、發病時間、病害發生規律、病害癥狀特點和樣品采集時間等，并進行編號。樣品裝入樣品采集袋中后，用冰盒保存帶回實驗室進行病原菌分離。

1.2 平菇病原菌分離鑒定

從病害情況調查結果可知，平菇病害主要由真菌引起，因此本次研究主要針對真菌進行分離鑒定。

1.2.1 培養基制備

孟加拉紅培養基：蛋白胨0.5%、葡萄糖1%、瓊脂1.5%～2.0%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、氯霉素0.01%、1/3 000孟加拉紅溶液10%，蒸餾水1 000 mL。

PDA培養基：馬鈴薯20%、葡萄糖 2%、瓊脂1.5%～2.0%，蒸餾水1 000 mL。

1.2.2 病原菌分離與純化

在超凈工作臺進行無菌操作，從染病的菌包上直接挑取小部分雜菌菌絲，接種在孟加拉紅培養基平板上，置于24℃培養箱中進行避光培養。培養3 d～6 d后，挑取病原菌菌落邊緣部分菌絲或帶菌絲的培養基至PDA平板上進行純化，重復操作直至獲得單一的菌落，于3℃～5℃冰箱中保存備用。

1.2.3 菌株鑒定

采用rDNA ITS序列分析法[14-16]對純化的病原菌菌株進行分析鑒定，樣品送至昆明碩擎生物科技有限公司進行DNA提取和測序，序列經過DNASTAR軟件進行拼接處理后在NCBI數據庫中進行BLAST序列比對，下載與樣品序列相似度較高的序列，用MEGA 6軟件構建系統發育樹，確定菌株的系統學發育地位。

2 結果與分析

2.1 平菇常見病害調查結果與分析

陸良縣作為平菇栽培重點縣，栽培多年后病害問題日益凸顯，通過本次調查發現，陸良縣平菇病害主要以真菌感染為主。不同的管理方式和不同的栽培場所病害發生程度差異較大。調查結果詳見圖1和表1。

由圖1和表1可知，此次陸良縣平菇病害調查，共采集病害樣品8份，采集地5個，其中4份樣品（4號～7號）采集自同一個采集地的3家栽培戶和1家菌包生產公司（陸良爨鄉綠圓菇業有限公司）栽培基地。從調查結果可知，平菇病害在菌絲培養階段和出菇階段都有發生，主要癥狀是菌包內部或出菇后的包口有雜菌感染，影響平菇產量。

圖1 平菇病害癥狀Fig.1 Symptoms of disease of Pleurotus ostreatus

從表1中可以看出，樣品1號和2號采集地的菌包由自己生產，常壓滅菌，菌絲培養階段開始發生病害，且開始感染的部位在菌包內部，說明感染是由菌包內部滅菌不徹底引起的。樣品1號采集地病害發生很嚴重，樣品2號采集地病害較輕。栽培戶自己進行常壓滅菌有一定風險，如果滅菌不徹底，菌包內部引起感染，感染情況較重的會嚴重影響出菇產量。樣品3號～8號菌包均來自正規廠家，高壓滅菌，菌絲培養階段不易發生病害，病害主要在出菇后產生。說明公司統一標準化生產更能保障菌包的質量，減少污染率。發生病害部位主要從包口開始，說明病害是從環境中感染引起。樣品7號為菌種生產公司的栽培基地，水分管理較差，病害為中度，其余5個栽培戶管理較為精細，病害均較輕。說明在平菇栽培過程中，在保障菌包品質的前提下，管理水平不足是造成病害加劇的主要原因。樣品1號采集地使用的品種平菇89是多年來平菇栽培中使用最多的品種，栽培戶自己進行菌種多代轉接，可能導致了菌種的退化，抗病性降低，也是導致病害嚴重的原因之一。樣品2號采集地用的品種平菇9號是自己多年馴化選育出來的新品種，樣品3號～8號都是菌種公司集中生產使用的新品種平菇灰2，從調查結果來看，平菇9號和平菇灰2的抗病性都較好。

表1 平菇病害調查結果Tab.1 Investigation results of diseases of Pleurotus ostreatus

根據病害調查結果分析發生病害的主要原因有4種。

1） 常壓滅菌有一定風險，滅菌不徹底，有蟲卵、雜菌殘留。加之夏季溫度高，在菌絲培養階段若翻堆不及時會導致菌包內料溫升高，平菇菌絲抗病能力下降，雜菌就會從菌包內部開始發生，蔓延至整個菌棒。并且蟲害還會加速整個場地菌包感染的蔓延速度，從而極大地影響產量。

2）正規廠家統一生產的菌包，有標準化、規范化的操作流程和高壓滅菌設施，能夠在一定程度上保障菌包的品質。但是在后期管理階段如果對水分的管理掌握不好，包口產生積水，也會導致菌包感染。在出菇后期，菌絲抵抗力變弱，感染就會加劇。

3）栽培戶常年自己進行菌包制作，如果菌種轉接次數過多，可能存在菌種退化的問題。品種本身對病害的抗性變弱，也會導致感染加劇。

4）平菇栽培一般可以采收三潮～五潮，從采收第一潮后，包口部位對外界病原菌的抵抗力會變弱。且隨著采菇潮數的增加菌絲抗感染能力會越來越弱，在采菇二潮～三潮后感染率就會增加。

2.2 平菇病原菌分離

從采集到的病害樣品中分離出優勢病原菌，編號為PGB-1～PGB-8，分離結果見圖2、表2。

由圖2、表2可知，從陸良縣5個地方8個樣地采集到的8份病害樣品中分離得到10個病原菌菌株。其中，5號和6號樣品中分別分離到2個菌株。

表2 病原菌分離情況Tab.2 Isolation of pathogenic fungi

圖2 病原菌菌落形態Fig.2 Colony morphology of pathogenic fungi

2.3 基于rDNA序列的病原菌系統發育分析

將 PGB-1、PGB-2、PGB-3、PGB-4、PGB-5、PGB-5-1、PGB-6、PGB-6-1、PGB-7、PGB-8 十個病原菌菌株的rDNA ITS序列在NCBI數據庫中進行BLAST序列比對，下載相似度較高且已在期刊發表的序列，同時下載了8個已發表的同屬序列作為對比序列，選取米根霉（Rhizopus oryzae）作為外群構建系統發育樹，確定菌株的系統學分類地位，詳見圖3、表3。

由圖3和表3可知，PGB-1、PGB-2、PGB-3、PGB-4、PGB-7、PGB-8病原菌菌株與木霉屬的平菇木霉（T.pleuroti）ITS序列相似度達到100%，在系統發育樹上也聚在同一支系上，結合菌落形態可確定從6個樣品中分離到的病原菌菌株PGB-1、PGB-2、PGB-3、PGB-4、PGB-7、PGB-8均為平菇木霉（T.pleuroti）。PGB-5和PGB-6菌株與椰青霉菌（P.copticola）的序列相似度達100%，且系統發育樹上聚在同一支系，結合菌落形態可確定從5號樣品和6號樣品中分離到的PGB-5、PGB-6兩個菌株為椰青霉菌。PGB-5-1菌株與歧皺青霉（P.steckii）的序列相似度為99.83%，系統發育樹中聚在同一支系上，結合菌落形態可確定菌株PGB-5-1為歧皺青霉（P.steckii）。菌株PGB-6-1與T.patella的序列相似度為99.64%，系統發育樹中聚在同一支系上，結合菌落形態可確定菌株PGB-6-1為T.patella。

圖3 基于ITS序列構建的NJ系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

表3 基于ITS序列系統發育樹分析表Tab.3 Phylogenetic tree analysis table based on ITS sequences

3 結論與討論

3.1 結論

云南陸良縣平菇栽培過程中菌包感染是最為常見的病害癥狀，也是影響最為嚴重的問題，主要發生在菌絲培養階段和第二潮菇采收后。菌絲培養階段發生病害的栽培地菌包基本是家庭式生產，常壓滅菌，病害發生原因為滅菌不徹底，發生感染的初期雜菌與平菇菌絲一同生長，后期雜菌逐漸覆蓋平菇菌絲，蔓延至整個菌包，菌包變軟、腐爛。

采收第二潮菇后開始發生病害的栽培地菌包基本為公司集中生產，高溫高壓滅菌，相對而言菌包品質更有保障。夏季氣溫升高、采菇后水分管理不當的情況下，易產生病害，多發生在包口，競爭性真菌感染后逐漸向包內蔓延至整個菌包。公司集中生產的菌包在不同的栽培基地表現出的污染情況有差異，說明同樣的出菇包，后期產量和污染率與出菇階段的管理技術關系較大。因此，在平菇栽培過程中，標準化的菌包制作和規范化的栽培管理能有效減少病害發生。

通過對分離純化后的病原菌進行rDNA序列分析，結果表明導致平菇菌包感染的病原菌菌株PGB-1、PGB-2、PGB-3、PGB-4、PGB-7、PGB-8 均為木霉屬的平菇木霉（T.pleuroti），病原菌菌株PGB-5、PGB-6為青霉屬的椰青霉菌（P.copticola），菌株PGB-5-1為歧皺青霉（P.steckii），菌株PGB-6-1為 T.patella。

3.2 討論

通過本次研究，共從8個陸良縣平菇栽培地感染菌包中分離到10個病原菌菌株，其中樣品1號、2號、3號、4號、7號和8號中均分離到木霉屬的平菇木霉（T.pleuroti），說明平菇木霉是陸良縣平菇病害的主要病原菌，在病害發生后作為優勢菌造成大面積危害，后期病害防治中應對該種進行針對性防御。樣品5號和6號中分別分離到2個菌株，有木霉屬真菌和青霉屬真菌，這兩個栽培場地病害較輕，尚未形成優勢病原菌產生較大的危害。

不同地區的病原菌菌株可能有所差異，曹現濤[17]、崔紅麗[18]、顏一紅[19]、劉正慧[20]等的研究表明，木霉屬的長枝木霉 （T.longibrachiatum）和側耳木霉（T.pleuroticola）、節從孢屬 （Arthrobotrys）、尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）是平菇、杏鮑菇、香菇、木耳等食用菌栽培生產中的主要病原真菌?？梢源_定的是，木霉屬真菌是平菇等食用菌栽培中的主要病原菌，且一旦發展為優勢菌株產生大面積污染，將造成較大的損失，因此在實際生產和栽培中應根據木霉屬真菌的生長特性進行針對性的防治。