不同分子量茯苓多糖抑制酪氨酸酶活性及抗炎功效的研究*

劉曉英，馬詩經(jīng)，韓 萍，林 麗，杜志云，車 飆

[1.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510000；2.佛山市康伲愛倫生物技術有限公司，廣東 佛山 528200；3.廣東工業(yè)大學生物醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510006]

作為中藥使用的茯苓，為多孔菌科（Polyporaceae） 真菌茯苓 [Poria cocos(Schw.)Wolf]的干燥菌核，常腐生或寄生于松科植物馬尾松或赤松根部，也被稱為松苓、茯兔、松柏玉等[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，也是我國藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材，國內(nèi)云南、安徽、湖北等為其主要產(chǎn)地[2]。茯苓味甘淡，性平，歸心脾經(jīng)，具有利水祛濕、健脾安神的功效[3]。研究發(fā)現(xiàn)，茯苓中富含多種化學成分，主要有三萜類、多糖類、甾醇類、氨基酸及微量元素等，其中三萜類和多糖類化合物為茯苓的主要活性成分[4]。現(xiàn)代藥理學表明，茯苓具有增強免疫力[5]、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗炎等功效[6-8]，被廣泛應用于藥品、食品及保健品領域中。皮膚色素主要包括黑色素、胡蘿卜素、褐色素等，目前皮膚美白主要是通過抑制黑色素的形成[9]。此外，氧自由基、皮膚炎癥及損傷也會導致皮膚色素增加或沉著[10]，因此抑制黑色素、褐色素的生成，以及消除皮膚自由基與炎癥是美白膚質(zhì)或降低色素沉著的有效途徑。目前應用的美白功效成分主要包括煙酰胺、熊果苷、光甘草定、抗壞血酸、水飛薊素、白藜蘆醇等，盡管以上成分對黑色素的生成、轉(zhuǎn)運、代謝等途徑具有良好抑制作用，但存在添加量大、水溶性差以及價格昂貴等問題。因此，開發(fā)天然來源、功效明確、價格低、水溶性良好的美白因子具有重要意義。

近年來，研究揭示了茯苓中三萜類成分對酪氨酸酶具有良好的抑制作用[11-12]，而逐漸被用于開發(fā)美白護膚類化妝品，關于茯苓多糖在美白方面的功效及其作用機制研究比較少。因此，本研究對茯苓采用超微粉碎處理，再進行工業(yè)化生產(chǎn)常用的熱水浸提工藝，以適宜的溫度使得茯苓多糖充分溶出，進一步將茯苓粗多糖通過醇沉、膜分離方法得到純化后茯苓多糖，并測定抗氧化活性、抗炎、抑制酪氨酸酶活性，分析不同截留相對分子質(zhì)量所得茯苓多糖對自由基清除、抑制炎癥、抑制酪氨酸酶活性的影響，以期為茯苓多糖在抗氧化、美白、消除炎癥護膚方面的研究開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

茯苓，佛山市康伲愛倫生物技術有限公司；葡萄糖標準品（純度＞99%），阿拉丁（Aladdin） 試劑公司；酪氨酸酶、二苯代苦味肼基自由基（DPPH）、脂多糖（LPS），上海西格瑪有限公司；無水乙醇、濃硫酸、苯酚等均為分析純，廣州化學試劑廠；蒸餾水，實驗室自制。

酶標儀1510，美國Thermo Fisher公司；UV-3600 Plus紫外可見光分光光度計，SHIMADZU公司；超微粉碎機WZJ-6B，濟南倍力粉體工程技術有限公司；電熱恒溫水浴鍋DK-S22，上海精宏實驗設備有限公司；離心機Z326K，德國Hermle公司；數(shù)控超聲波清洗器KQ3200DE，昆山市超聲儀器有限公司；高速萬能粉碎機DYF-400C，上海利聞科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同分子量茯苓多糖的制備

取茯苓干制品置于60℃烘箱干燥20 min后，經(jīng)高速萬能粉碎機粉碎并過100目篩，然后用超微粉碎機進行超微粉碎10 min，得到茯苓超微粉。參照參考文獻[13]的方法并進行調(diào)整，稱取1 kg茯苓超微粉加入水，料液比為1∶30，浸泡20 min后100℃下提取2 h，經(jīng)300目過濾，濾液備用。濾渣再加入水，料液比為1∶15，按上述條件重復提取1次，合并提取液經(jīng)300目過濾后，65℃減壓濃縮至體積的1/10。經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min，取上層清液加入4倍體積的95%乙醇進行沉淀后減壓抽濾，沉淀物依次用無水乙醇、丙酮洗滌3次。將沉淀物冷凍干燥（-50℃，48 h）成粉末后，按照文獻方法進行脫蛋白處理5次[14]，再經(jīng)冷凍干燥（-50℃，48 h），得茯苓多糖凍干粉（記為PW-P1），測定粗多糖含量。

采用醇沉、聯(lián)合膜分離工藝制備茯苓多糖[15-16]。取離心后的茯苓提取液，在0.1 MPa、30℃、截留相對分子質(zhì)量為5 kDa、10 kDa超濾膜條件下進行超濾，分別收集截留相對分子質(zhì)量為5 kDa、10 kDa的茯苓提取液，并在65℃濃縮至提取液體積的1/10，濃縮液中加入4倍體積的無水乙醇，放置過夜后，5 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液得沉淀，并按1.2.1項下方法脫蛋白后冷凍干燥（-50℃，48 h）得茯苓多糖凍干粉，分別將截留相對分子質(zhì)量為5 kDa、10 kDa超濾膜分離所得的茯苓多糖將記為PW-P2、PW-P3，進行體外活性測試。

1.2.2 茯苓多糖含量測定

1） 葡萄糖標準曲線的制作

采用苯酚硫酸法測定[17]，稱取適量葡萄糖標準品，置于105℃烘箱中烘至恒重后，稱取100 mg葡萄糖標準品，在100 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。精密吸取葡萄糖標準儲備液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，置于 10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，配制成含葡萄糖0、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1的系列葡萄糖標準溶液。分別移取上述系列葡萄糖標準溶液各1 mL，置于10 mL具塞玻璃試管中，依次加入0.5 mL的5%苯酚溶液，2.5 mL濃硫酸搖勻，靜置5 min，90℃水浴加熱20 min，然后冰浴冷卻至室溫。另取1 mL蒸餾水，按照上述操作，作為空白對照。將上述溶液分別在490 nm波長處測定吸光度值，以葡萄糖標準溶液濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

2）茯苓多糖含量的測定

取茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3溶于水中，并稀釋至一定質(zhì)量濃度，吸取1 mL于10 mL具塞試管中，按照1.2.2中1） 項的步驟進行操作，測定吸光度值，由標準曲線計算出多糖濃度，按以下公式計算茯苓多糖含量（X，%）：

式中：C為測得茯苓多糖的濃度（mg·mL-1）；V為提取液的體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)；0.9為葡萄糖換算成多糖的正交系數(shù)。

1.2.3 茯苓多糖DPPH自由基清除能力的測定

參照參考文獻[18]方法，測定茯苓多糖PWP1、PW-P2、PW-P3的DPPH自由基清除能力。分別取 1 mL 濃度為 0.01 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、 0.20 mg·mL-1、 0.40 mg·mL-1、 0.80 mg·mL-1的PW-P1、PW-P2、PW-P3溶液于試管中，分別加入0.1 mmol·L-1DPPH溶液1.0 mL，充分混勻后避光反應20 min，在517 nm處測定吸光度值Ai。VC做為陽性對照，對照組以無水乙醇代替DPPH溶液，測定吸光度值Aj。空白組以蒸餾水代替多糖溶液，測定吸光度值為A0。DPPH自由基清除率（C，%）的計算公式為：

式中：A0為空白組吸光度值；Ai為茯苓多糖吸光度值；Aj為對照組吸光度值。

1.2.4 茯苓多糖對RAW264.7細胞的作用

測定茯苓多糖對RAW264.7細胞的作用[19-20]。小鼠巨噬細胞系RAW264.7在含有10%FBS胎牛血清、1%雙抗（鏈霉素100 mg·mL-1、青霉素100 U·mL-1）和90%DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細胞長滿培養(yǎng)瓶后，按體積1∶3的稀釋比對細胞進行傳代培養(yǎng)。在 96孔板中加入 8×103個/孔對數(shù)期生長的RAW264.7細胞，37℃、5%CO2條件下孵育過夜。加入濃度為 0～100 μg·mL-1的茯苓多糖 PW-P1、PWP2、PW-P3處理24 h，每孔中加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h后棄上層培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO解甲醛染料，避光震蕩10 min，用酶標儀于492 nm處測定吸光度值。

1.2.5 茯苓多糖對LPS誘導的RAW264.7細胞NO分泌量的影響

細胞株用內(nèi)含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈對數(shù)生長，每24小時更換培養(yǎng)基，細胞生長至60%～70%傳代。細胞分組及干預細胞分為12組，分別為空白組、LPS模型組、PW-P1組、PW-P2組、PW-P3組。取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞株，以2×106個/mL的密度接種于6孔板上，培養(yǎng)箱中孵育24 h后給藥。空白組加入完全培養(yǎng)基，LPS組加入使最終質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1的LPS，給藥組分別加入使最終質(zhì)量濃度為 50 μg·mL-1、250 μg·mL-1、500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1的樣品和 2 μg·mL-1的 LPS，使每組的總體積為3 mL，并放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

收集細胞上清液，嚴格按照NO檢測試劑盒說明書進行測定。采用完全培養(yǎng)基作為稀釋液稀釋原始濃度為1 mol·L-1的標準品溶液NaNO2。按照150 μL/孔，在96孔板中加入各濃度的對照品溶液及樣品50 μL，Griess Reagent Ⅰ液及Ⅱ液各 50 μL，于 37℃培養(yǎng)箱中孵育10 min。振蕩器上震蕩5 min后于酶標儀540 nm處測定記錄各孔吸光度值。

1.2.6 茯苓多糖對酪氨酸酶活性的抑制作用測試

研究報道酪氨酸酶可以催化L-多巴生成多巴色素，多巴色素在波長475 nm處具有最大吸收值。參照參考文獻[12]的方法并略作調(diào)整，酪氨酸酶活性抑制試驗利用L-酪氨酸作為底物進行催化反應，用比色法于475 nm處測定吸光度變化。選擇抑制反應試驗條件為：溫度37℃，水浴恒溫10 min，pH6.8，再反應時間10 min，加入L-酪氨酸的濃度為0.6 mmol·mL-1，酶液量為1.0 mL（97 IU·mL-1）。反應中不同濃度的樣品溶液 （包括 0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、6.0 mg·mL-1的茯苓多糖；0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1的 VC）、二甲亞砜 （DMSO）、磷酸緩沖液（PBS）、酪氨酸酶液及L-酪氨酸的添加量見表1，各比色管分別編號為1號、2號、3號、4號。將水浴鍋內(nèi)的比色管取出，快速測定其在475 nm處的吸光度值。重復以上步驟，進行3次平行實驗，求得平均值，按以下公式計算酪氨酸酶酶活的抑制率（IR，%）：

表1 待測液的組成Tab.1 Composition of samples prepared for test of tyrosinase activity

式中：A1為1號比色管溶液的吸光度值；A2為2號比色管溶液的吸光度值；A3為2號比色管溶液的吸光度值；A4為2號比色管溶液的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓多糖的含量測定

以葡萄糖標準液濃度（mg·mL-1）為橫坐標，吸光度值（Abs）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

得到的葡萄糖標準液線性回歸方程為：

回歸方程的相關系數(shù)R2為0.999 8，表明葡萄糖標準品在0～0.10 mg·mL-1內(nèi)濃度與吸光度值呈良好的線性關系。

進一步測定茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3的粗多糖含量，見表2。

表2 茯苓多糖的粗含量Tab.2 The content of Poria Cocos(Schw.)Wolf polysaccharides

如表2所示，茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PWP3的粗多糖含量分別為96.46%、93.18%、92.25%。

2.2 茯苓多糖的DPPH自由基清除率

采用醇沉、聯(lián)合膜分離技術經(jīng)純化得到不同分子量范圍的茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3，進一步通過體外抗氧化測試，評價其對DPPH自由基清除效果，并與VC進行對照，對DPPH自由基清除率結(jié)果見圖2。

圖2 茯苓多糖的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging rate of Poria cocos polysaccharides

如圖2所示，在設定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同分子量的茯苓多糖對DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)出濃度依賴性，PW-P1、PW-P2、PW-P3在質(zhì)量濃度為 0.01 mg·mL-1～0.40 mg·mL-1對 DPPH 自由基清除率范圍分別為3.65%～29.75%、5.92%～31.44%、7.39%～62.74%。質(zhì)量濃度為0.8 mg·mL-1時，對DPPH自由基清除率分別為39.35%、49.88%、62.74%。計算得到 PW-P3的 IC50為 0.45 mg·mL-1，而 PW-P1與PW-P2的IC50則大于0.8 mg·mL-1。在同樣濃度下，VC對DPPH自由基清除率高于PW-P1、PW-P2、PW-P3，其IC50為0.14 mg·mL-1。從以上抗氧化結(jié)果分析，對不同分離工藝獲得的茯苓多糖抗氧化功效而言，截留相對分子質(zhì)量為10 kDa的PW-P3抗氧化功效優(yōu)于截留相對分子質(zhì)量為5 kDa的PW-P2、醇沉分離的PW-P1，說明不同分離工藝影響茯苓多糖的抗氧化活性，可能與其分子量的大小有關。

2.3 茯苓多糖對RAW264.7細胞活性的影響

茯苓多糖對RAW264.7細胞活性影響的結(jié)果見表3。

表3 茯苓多糖對RAW264.7細胞活性的影響Tab.3 The effect of Poria cocos polysaccharides on RAW264.7 cell viability

如表3所示，不同濃度的茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3處理RAW 264.7細胞24 h后，使用MTT法檢測細胞活性發(fā)現(xiàn)，在濃度為1 μg·mL-1～1 000 μg·mL-1茯苓多糖作用下，RAW264.7 細胞活性均保持在93%以上。與對照組的細胞活性相比，不同工藝分離的茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3在上述劑量范圍內(nèi)對RAW264.7細胞增殖沒有明顯的抑制效果，后續(xù)采用該系列濃度進行抑制RAW264.7細胞NO分泌的測試。

2.4 茯苓多糖對LPS誘導RAW264.7細胞NO分泌的抑制作用

細菌、真菌、組織外傷、紫外線、外源性化學物質(zhì)等都有可能誘發(fā)機體炎癥，脂多糖LPS（lipopolysaccharide，LPS） 是革蘭氏陰性菌細胞壁外壁的組成成分，作用于機體時容易引起強烈炎癥反應。LPS誘發(fā)炎癥發(fā)生過程，由NO合酶（nitric oxide synthase，NOS） 催化 L-精氨酸 （L-Argine） 而生成一氧化氮（nitric oxide，NO），被LPS激活的巨噬細胞可以大量分泌NO，導致周圍組織的損傷[21]。采用濃度為 50 μg·mL-1～1 000 μg·mL-1的茯苓多糖 PW-P1、PW-P2、PW-P3 作用于濃度為 2 μg·mL-1LPS誘導的RAW264.7細胞，考察不同分子量的茯苓多糖對RAW264.7細胞分泌NO的影響，結(jié)果詳見表4。

表4 茯苓多糖對LPS誘導RAW264.7細胞NO分泌的抑制作用Tab.4 Inhibitory effect of Poria cocos polysaccharides on NO secretion induced by LPS in RAW264.7 cells

由表4可知，與空白組相比，LPS干預后的RAW264.7細胞模型組分泌的NO顯著升高（P＜0.001），說明了在此濃度下的LPS對RAW264.7細胞造成了顯著的炎癥性反應。與模型組相比，茯苓多糖 PW-P2、PW-P3 在濃度為 50 μg·mL-1～1 000 μg·mL-1對LPS誘導NO的分泌具有顯著的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），茯苓多糖 PW-P1 則在濃度為 250 μg·mL-1～1 000 μg·mL-1時能顯著降低NO的分泌 （P＜0.05，P＜0.01），且呈濃度依賴性。與PW-P1相比，經(jīng)過超濾截留收集所得相對分子量較為集中的茯苓多糖PW-P2、PW-P3，在低濃度時顯效抑制LPS誘導產(chǎn)生NO，初步實驗結(jié)果與劉曉菲等[22]采用經(jīng)純化后羧甲基茯苓多糖對對脂多糖（LPS） 誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7有一定抑制作用的結(jié)果一致。

2.5 茯苓多糖對酪氨酸酶活性的影響

在人體皮膚黑色素合成的過程中，酪氨酸酶及其活性起著關鍵作用[23]，目前評價中草藥提取物美白功效的體外常用方法為抑制酪氨酸酶活性試驗[24]。研究證實茯苓中三萜類物質(zhì)對酪氨酸酶具有抑制作用[11-12]，但茯苓多糖對酪氨酸酶的活性影響卻鮮有報道。為了分析茯苓多糖對酪氨酸酶活性的影響，采用濃度為 0.5 mg·mL-1～6.0 mg·mL-1茯苓多糖PWP1、PW-P2、PW-P3，以及濃度為 0.1 mg·mL-1～0.5 mg·mL-1VC測定酪氨酸酶的抑制率，結(jié)果見表5。

表5 茯苓多糖對酪氨酸酶的抑制率Tab.5 Tyrosinase inhibition rate of Poria cocos polysaccharides

由表5可知，在濃度0.5 mg·mL-1～6.0 mg·mL-1范圍內(nèi)的茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3對酪氨酸酶活性有一定的抑制作用，并且隨著質(zhì)量濃度的增加抑制作用逐漸增強，在濃度為6.0 mg·mL-1時，茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3對酪氨酸酶活性的最大抑制率分別為24.21%、35.39%、38.11%，也進一步說明不同分離工藝影響茯苓多糖的抑制酪氨酸酶活性，其可能與茯苓多糖的分子量大小有關。VC在濃度為0.5 mg·mL-1時對酪氨酸酶活性抑制率為69.47%，其IC50為0.39 mg·mL-1。盡管在設定濃度范圍內(nèi)，茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3均未達到酪氨酸酶IC50抑制率，但仍能夠有效地抑制酪氨酸酶活性，由此可見，茯苓多糖PW-P1、PWP2、PW-P3可作為一種天然美白活性成分應用于美白類化妝品。

3 結(jié)論

本研究采用超微粉碎預處理熱水浸提法提取茯苓多糖，通過醇沉、聯(lián)合膜分離的不同分離方法制備茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3，其粗多糖含量分別為96.46%、93.18%、92.25%。進一步測定茯苓多糖PW-P1、PW-P2、PW-P3的DPPH自由基清除率、LPS誘導RAW264.7細胞NO分泌的抑制率及酪氨酸酶活性抑制率，均呈現(xiàn)出良好的量效關系，同時試驗初步證實在此工藝條件下制得的茯苓多糖，具有一定的抗炎及抑制酪氨酸酶的活性，且與茯苓多糖不同分子量分布有關，而茯苓多糖的抗炎、美白活性及其作用機理還有待進一步研究。這為茯苓多糖的體內(nèi)抗炎及美白研究提供了理論依據(jù)，為茯苓的精深加工應用提供了參考。