紅托竹蓀液體菌種生產技術應用*

陳翠翠，方 曄，鞏玉輝，莊繼文，張 軍

（貴州金蟾大山生物科技有限責任公司，貴州 畢節 553300）

紅托竹蓀（Dictyophora rubrovolvata），屬于鬼筆科 （Phallaceae） 竹蓀屬 （Dictyophora）[1]。子實體具有氣息清香、味道鮮美、肥厚脆嫩、久煮不爛等特點，深受廣大消費者的喜愛，市場需求量巨大。目前，常規紅托竹蓀菌種的生產多采用固體培養基，而該菌種的生物學特性決定了其生長周期較長，一般母種、原種、栽培種三級培養周期需7個月[2-3]，導致生產效率不高，菌齡難以調整一致，在培養過程中往往存在瓶（袋）內底部菌種還未長滿、上部菌種就已經開始老化萎縮的現象。

在規模化生產中，受菌種擴繁代數的影響，母種可能源于不同子實體分離的菌株，造成同批次菌袋出菇差異大等問題。另外，由于固體菌種生長周期長，菌種污染率也會隨著培養期延長而上升，生產中常因菌種挑選鑒別不細致，導致接種后菌袋污染率居高不下，造成嚴重經濟損失。

紅托竹蓀液體菌種成功應用于菌包工廠化生產，并于2020年生產工藝取得突破，經不斷改進成熟，可將菌種培養周期縮短到50 d內，接種成本降低近90%。目前，已利用此項技術生產菌包3 500多萬袋，并通過了大田出菇驗證。此技術的利用不僅大幅度提高了紅托竹蓀菌種生產效率，其生物轉化率也得到了明顯提高，為今后紅托竹蓀的工廠生產奠定了基礎。以下將對該技術流程進行介紹。

1 紅托竹蓀液體菌種生產

1.1 菌種來源

選用金蟾大山生物科技有限責任公司選育的JCZS-14-33優良紅托竹蓀菌種。

1.2 液體菌種生產過程

紅托竹蓀液體菌種常規的生產工藝流程見圖1。

圖1 紅托竹蓀液體菌種常規的生產工藝流程Fig.1 Production process of Dictyophora rubrovolvata liquid spawn

由圖1所示，紅托竹蓀液體菌種的制作包括母種的篩選、分離純化后母種的純培養、搖瓶擴大培養、發酵擴大培養、接種后菌包工廠化培養，直至菌絲長滿菌包用于栽培。

1.3 母種分離

紅托竹蓀母種培養是至關重要環節，母種品質的優劣，會直接影響產量高低和栽培成敗。母種分離主要包括子實體選擇、培養基制備、純種分離、轉管擴繁、菌絲培養、保存及使用等環節。

1.3.1 子實體選擇

選擇抗病性強、豐產、商品性狀好的優良菌株作分離用種，子實體應選擇無病害，近六成、七成熟，個體肥大、結實、頂端無凸起，包被無裂縫，內部未分化的菌蕾（竹蛋）。菌蕾不可過大或者過小，采集適齡期的竹蛋利于分離出活力強、健壯的母種[1-4]。

1.3.2 菌種分離

采用組織分離法獲得母種菌絲體[3-4]。將選擇好的菌蕾，先用清水洗去表面泥土，再用75%酒精進行表面消毒后，于超凈工作臺紫外燈下照射15 min～20 min，對菌蕾進行表面滅菌和水分去除。后用無菌手術刀在無菌操作臺的酒精燈下，沿菌蕾表皮劃十字，露出子實層托，并將其切成0.2 cm～0.3 cm左右的小方塊（約如黃豆粒大?。?，迅速轉接到無菌平板培養皿或試管斜面培養基中，封口。

1.3.3 菌絲培養

將分離好的培養皿或試管放入22℃～25℃恒溫培養箱內培養2 d～3 d，待菌絲生長至直徑約3 cm，選取菌絲生長規則的培養皿或試管，挑取尖端內部0.5 cm處的菌絲進行轉接純化培養，轉接方法同常規[5]。紅托竹蓀菌絲生長較慢，生長速度每天約1.8 mm，一般長滿直徑9 cm的平板約需22 d～25 d，培養期間要定期檢查，及時挑選出污染和發菌慢的菌塊[6]。

1.3.4 菌種檢測

轉接純化的培養皿或試管的菌絲長滿培養基后，挑取未感染、菌絲生長均勻的培養皿或試管菌種，立即進行菌種的轉接擴繁，對分離菌種進行出菇測試。經過出菇試驗后的菌種稱為一代菌種，保存作為生產擴繁菌種使用[7，9]。經過經驗總結，一代菌種感官檢測標準見表1。

表1 一代母種感官檢測標準Tab.1 Sensory test standard of the first generation stock culture

由表1可知，在制作一代母種時培養基較一般食用菌厚度偏厚，菌絲要求生長均勻，具有無角變、生長不規則、無感染等特點，菌絲潔白、濃密，不會出現生長過快或者過慢的現象，具有穩定性。

一代母種再經一次提純擴繁后，稱為二代母種，是可供生產使用的主要菌種[5]。經過經驗總結，二代母種感官檢測標準及不同培養時間生長情況見表2、圖2。

由表2、圖2可知，優質二代母種培養20 d～25 d時菌絲可以長滿平板，菌絲生長均勻，生長速度穩定、無角變、無感染、無顆粒狀、無刺激變紅菌絲，菌絲潔白、濃密，具有穩定性。

圖2 不同培養時間生長情況Fig.2 Growth with different cultivation time

表2 二代母種感官檢測標準Tab.2 Sensory test standard of the second generation stock culture

1.3.5 菌種擴繁

由于食用菌菌種的生長特性，因此生產中要注意菌種的穩定性[8-9]，注意觀察菌落形態是否正常，整批次培養時菌絲生長是否均勻，生長速度是否異常，有無雜菌污染、角變、色素產生、粉孢子產生等現象。因此，只有每個批次的二代菌種及N代菌種的感官標準均符合二代母種感官檢測標準，才能進行菌種擴繁，否則不可用于生產。

2 菌種培養基的制作

2.1 固體培養基的配方

土豆100 g（煮水過濾）、葡萄糖5 g、果糖25 g、蛋白胨5 g、硫酸銨2.5 g、雜木屑70 g（粒徑100目）、瓊脂粉18 g，水1 000 mL。

2.2 液體培養基的配方

葡萄糖5 g、果糖25 g、酵母粉1 g、硫酸銨2.5 g、磷酸二氫鉀1 g、玉米粉8 g、木屑80 g（粒徑100目，煮水過濾），水1 000 mL。

3 液體菌種制作

3.1 母種轉接

液體培養基裝入250 mL玻璃三角瓶內封口，經常規高壓滅菌冷卻后，連同經挑選合格的母種一起，進行表面消毒后放置超凈工作臺上。按照無菌操作在工作臺酒精燈下，選取距離老菌塊中心2 cm～3 cm的菌絲，用解剖刀或打孔器，切成2 mm×2 mm小菌塊，迅速接入三角瓶中并封口。

3.2 搖瓶培養

將接種后的三角瓶放在恒溫搖床上進行培養，培養溫度為25℃，培養時間14 d。使用菌種前3 d時，在無菌環境下，接種菌種每瓶用移液槍取2 mL液體，平均接種到3個平板培養皿中，放入培養箱中28℃培養，3 d后觀察菌絲萌發與污染情況，將經檢測菌絲萌發不合格、有感染、生長狀態不佳等的菌種全部剔除。對檢測合格后的菌種進行平板拍照、搖瓶狀態拍照備案，即可供后續接種使用。

3.3 營養液制備與滅菌

按照2.2配方準備所需的營養料用水稀釋，并充分溶于水中，倒入培養罐內用凈化水補足至培養罐規定的水位。再經通氣攪拌均勻后，取樣測定其理化指標是否在規定范圍內，符合標準后蓋上罐蓋并擰緊螺絲，啟動加熱進行滅菌。當天配好的發酵液必須當天滅菌。滅菌時要求培養罐內液體溫度達到121℃～122℃，滅菌時間50 min～60 min[7]。滅菌結束后要盡快對培養罐進行降溫，以避免罐內培養基繼續保持高溫導致水分過度揮發。在滅菌結束冷卻后嚴禁培養罐產生負壓，使罐壓保持在0.03 MPa～0.05 MPa以防止罐內液體倒流發生污染。

3.4 接種

當培養罐內液體溫度冷卻至25℃～26℃時即可接種，接種時嚴格按照培養罐操作規程執行。采用火焰接種法，將檢測好的搖瓶菌種接入培養罐中，接種完畢將罐壓調至0.02 MPa～0.03 MPa，溫度調至26℃進行通氣培養。根據實際生產要求，液體菌種在使用之前48 h、24 h必須進行取樣檢測分析，確保無任何雜菌感染后，方可應用到生產中。

3.5 發酵培養

在發酵培養過程中，每天早上用二氧化碳測定儀檢測培養罐排氣口內的二氧化碳含量，同時根據生產需求，調節通氣量、培養溫度等控制菌球大小。通氣量大時，菌球會不斷被打散變??；溫度低時，菌球生長慢、菌球大；溫度高時，菌球生長快、菌球小。檢測時應對異常培養罐進行取樣分析，判斷是否污染。由于每種食用菌均有獨特的氣味，因此在檢測中凡是出現酸味、臭味，均視為已被細菌、霉菌等感染，應立即停止培養罐工作，并取樣檢測分析原因。對感染的培養罐需經過滅菌之后再進行清理，清理后要檢查、更換所有培養罐的配件，經空消后才能使用。

3.6 液體菌種的使用

經驗總結，當培養罐內營養液由濃稠變清透，菌球密度達到90%以上，二氧化碳處于上升階段，一般不超過0.3%，液體種產生小氣泡時說明菌絲發酵培養已經成熟，經檢測無污染即可用于生產。將接種管道按照無菌操作規程連接到培養罐，然后調整罐壓打開接種閥，通過人工或者液體接種機接至滅菌冷卻好的菌包中，接種量約40 mL～50 mL。接種后要立即轉入長菌室進行恒溫培養，前3天溫度為23℃～26℃，從第4天開始下調溫度為22℃～25℃，持續培養至菌絲長滿菌袋為止。紅托竹蓀液體菌種接種后，菌絲萌發時間為24 h～48 h，但萌發時間受培養室溫度、培養料水分和培養基pH等因素影響，會存在一定的差別。一般16.5 cm×35.0 cm×0.006 cm的栽培袋，從接種到菌絲發滿菌袋僅需70 d左右，菌種長滿袋后5 d～10 d即可用于栽培。

4 紅托竹蓀固體菌種與液體菌種的對比分析

4.1 生產工藝對比分析

紅托竹蓀固體菌種與液體菌種的生產工藝有很明顯的差異，固體生產與液體生產的具體工藝對照見圖3。

圖3 液體菌種與固體菌種工藝生產對比圖Fig.3 Production comparison of liquid spawn and solid spawn

由圖3可知，液體菌種的生產工藝與固體菌種的生產工藝相比省卻了原種、栽培種的生產、培養時間以及固定資產投入，減少了約6個月的制種周期。

4.2 菌種品質對比分析

1） 周期短

液體菌種具有生產周期短、菌絲生長快的優勢，紅托竹蓀的培養罐液體菌種培養7 d即可使用，而固體菌種則需要培養90 d以上。

2）菌齡一致且菌種活力高

紅托竹蓀的菌絲生長速度較慢，每天約生長1.8 mm～2.2 mm，因此傳統固體菌種生長到后期會存在底部菌種未長滿而上部菌種已出現老化、萎縮等現象。菌齡不一致，二者菌齡會相差3月～4月，由于菌種活力不一致，擴繁后差異會逐級擴大，導致最終的產量差異。液體菌種則可成功解決此難題，液體菌種培養時間一致，在菌種最佳活力期（二氧化碳未處于下降狀態，菌種濃度達標）用于接種，接種后24 h～48 h可見萌發，解決了菌齡不一致的問題。

3） 污染率低

紅托竹蓀的菌絲活力很強，在生產中若挑選不及時會出現紅托竹蓀菌絲將雜菌覆蓋的現象，與其他食用菌不同，紅托竹蓀與雜菌間不會出現明顯的拮抗線，因此隱形污染率較大，且培養周期長又增加了菌種感染的風險，在菌種使用過程中會逐級擴大污染[8]。傳統的固體菌種的污染率一般都在10%以上，但使用液體菌種在生產中若嚴格按照無菌操作，培養罐感染的風險非常低，而且通過檢測可很快查出風險培養罐，因此液體菌種的菌種純度可達100%，提升了紅托竹蓀菌種品質。

5 結論

長期以來紅托竹蓀的菌種生產均采用固體菌種，但其菌絲生長速度慢的特性決定了其生長周期較長，造成生產效率不高，菌齡難以控制。在規模化生產中，受菌種擴繁倍數的影響，母種可能由不同竹蓀子實體的分離，造成遺傳基因多樣，同批次菌棒出菇差異大等問題，導致接種后菌棒污染率居高不下，造成嚴重經濟損失[8，12-14]。而采用液體菌種生產方式制作紅托竹蓀出菇菌棒，可以極大地減少固體菌種的生長周期；液體菌種擴繁倍數的加大解決了固體菌種擴繁倍數小，母種需求量大的問題，液體菌種制作的所有菌包、菌種均為同一菌株，遺傳性狀穩定。因此，紅托竹蓀液體菌種的應用，將為紅托竹蓀大規模工廠化生產提供保障。