缺氧誘導因子1α（HIF-1α）和雙腎上腺皮質激素樣激酶1（DCLK1）在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

潘燕芳，李秋云，趙旁益，姜海雅

（廣西柳州鋼鐵集團有限公司醫院，廣西柳州 545002）

直腸癌好發于老年人群，在我國平均每十萬人中有10.1 人因結直腸癌而死亡，臨床上對于結直腸癌的診治提倡早發現、早確診、早治療，以增加患者生存幾率、提升其生活質量[1]。目前，主要篩查與診斷方式包括結腸鏡、血液腫瘤標志物檢測、計算機斷層攝影仿真腸鏡等[2]。早期直腸癌患者通過手術治療可以痊愈，但是當患者出現臨床癥狀時，病變往往已經是進展期。隨著醫療技術創新，腫瘤標志物檢測因操作簡單、痛苦小等優越性而容易被患者接受，因而檢測腫瘤標志物成為確定診斷、指導治療惡性腫瘤的重要工作之一[3]。HIF-1α 是缺氧狀態下細胞分泌的核蛋白，與相關靶基因結合后可促進腫瘤組織中血管新生[4]；DCLK1 作為腫瘤干細胞的一種生物標志，在腫瘤發生發展中起著重要作用[5]，其表達上調可參與腫瘤發生過程并能改變腫瘤細胞對化療的敏感性[6-7]。然而，上述兩種蛋白質與結直腸癌發生發展的相關性仍未明確。因此，本研究通過回顧性分析100 例結直腸癌患者的臨床資料，觀察HIF-1α 和DCLK1 兩種生物標志物在結直腸癌組織中的表達情況及兩者的關系，并研究其與腫瘤相關臨床特征的相關性。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年2 月至2019 年7 月廣西柳州鋼鐵集團有限公司醫院收治的100 例結直腸癌患者的臨床資料進行回顧性分析。男性50 例，女性50 例；年齡38～71 歲，平均（47.35±9.16）歲；腫瘤分化程度（TNM 分期）：高、中、低分別為18、51、31 例。納入標準：①符合結直腸癌[8]的臨床診斷；②病理學、分子生物學等資料均完整。排除標準：①HIF-1α、DCLK1 檢測結果不明確、無法判定結果者；③合并重要器官功能障礙者；④入院前曾接受過放射治療、化學治療等治療方法（診斷性手術除外）者。本研究經由廣西柳州鋼鐵集團有限公司醫院醫學倫理委員會審批。

1.2 方法 所有患者均經手術獲得病理標本并被明確診斷為結直腸癌，收集其結直腸癌組織標本，應用免疫組化技術予以HIF-1α、DCLK1 檢驗。檢驗過程如下：取結直腸癌組織石蠟切片4 μm（賽默飛HM3555型切片機），70 ℃烤片2 h（湖北康強TKD-KP 型烤片機），按照LEICA BOND-MAX 規范流程上機染色，EnVision 兩步法，一抗孵育時間20 min，封片。DCLK1 購自福州邁新生物技術開發有限公司，HIF1a購自北京中杉金橋生物技術有限公司。兩種蛋白的表達量均采用免疫組化法（即鏈霉菌親和素-過氧化物酶法）測定。

1.3 觀察指標 ①HIF-1α/DCLK1 陽性率：按結直腸癌組織石蠟切片染色結果判定標準，在各切片隨機選擇高表達視野5 個，各視野計瘤細胞100 個，HIF-1α、DCLK1 蛋白表達陽性細胞數量（n）＜10%為陰性，10%≤n ＜50%為陽性，50%≤n ＜75%為強陽性，n ≥75%判斷為極強陽性。陽性率為結果被判定為陽性、強陽性及極強陽性例數占總例數之比。②不同臨床特征的HIF-1α 及DCLK1 陽性率：腫瘤直徑、腫瘤腸壁侵襲程度、淋巴結轉移情況、不同腫瘤分化程度及TNM分期下，HIF-1α 及DCLK1 陽性率的差異。③通過在光學顯微鏡下對組織切片觀察，分別按染色程度（0～3 分，分別對應陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍（1～4 分，分別對應 0%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%）對患者的結直腸癌組織HIF-1α/DCLK1 蛋白表達量進行評分。

1.4 統計學分析 采用SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料用[例（%）]表示，非等級資料行χ2檢驗，等級資料行Wilcoxon 秩和檢驗。HIF-1α、DCLK1 表達之間的關系及兩者與臨床病理特征之間的關系行Pearsonχ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α/DCLK1 陽性率 患者HIF-1α、DCLK1 表達陽性率分別為62%（62/100）、43%（43/100）。鏡下觀見圖1、圖2。

圖1 HIF-1α 陽性（×100 EnVision 兩步法）

圖2 DCLK1 陽性（×100 EnVision 兩步法）

2.2 不同臨床特征下HIF-1α、DCLK1 陽性率比較 不同腫瘤直徑的結直腸癌患者，其HIF-1α 及DCLK1 陽性率的差異無統計學意義（P ＞0.05）。腫瘤腸壁侵襲程度深、發生淋巴結轉移、腫瘤分化程度更低、TNM 分期更低的患者，HIF-1α 陽性率更高，差異有統計學意義（P ＜0.05）。同樣，腫瘤腸壁侵襲程度深、發生淋巴結轉移、腫瘤分化程度更低、TNM 分期更低的患者，DCLK1 陽性率更高，差異有統計學意義（P ＜0.05）。這說明HIF-1α、DCLK1 的表達可能與腫瘤直徑、腫瘤腸壁侵襲、淋巴結轉移、腫瘤分化及TNM 分期之間存在一定關聯，見表2。

表2 結直腸癌患者不同臨床特征下HIF-1α、DCLK1 表達率比較（n=100）

2.3 HIF-1α 聯合DCLK1 檢測在結直腸癌組織表達相互關系 Pearson 相關性分析結果顯示，結直腸癌組織中HIF-1α 與DCLK1 表達量評分呈正相關（r=0.572，P=0.029），見圖3。

圖3 患者結直腸癌組織 HIF-1α 與DCLK1 表達量評分的關系

3 討論

據不完全統計結果顯示，我國結直腸癌患者已經占據大腸疾病70%左右，主要累及直腸與乙狀結腸交界處，是臨床消化系統發生率較高的惡性疾病、致死率較高[9]。該病早期無顯著臨床特征，出現腹痛等癥狀多為進展期病變，因此，提前預防、及時治療十分重要。

有研究證實，正常結直腸組織出現嚴重缺血缺氧時，HIF-1α 的表達量增加，通過活化Notch 信號通路（該信號轉導途徑參與調節腸發育和腸上皮更新）等途徑促進直腸癌細胞發展[10]。

有研究表明，HIF-1α 在結腸癌的晚期、淋巴結轉移的患者腫瘤細胞中HIF-1α 表達水平要高于早期及未發生淋巴結轉移者[11]。HIF-1α 能夠以調節多個靶基因的方式，幫助腫瘤細胞適應缺氧環境，且HIF-1α 在惡性腫瘤組織中存在高表達情況，提示HIF-1α 蛋白與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移存在相關性[12-13]。DCLK1 為腫瘤干細胞的生物標志物之一，有研究表明，癌細胞內DCLK1 表達被抑制后，可使腫瘤細胞的成瘤性顯著下降[14]，這說明DCLK1 和結直腸癌的產生有關。本研究結果顯示，HIF-1α、DCLK1 陽性率分別為62%、43%，分別與吳晨晨等[15]、樂安君等[16]報道的陽性率相似。腫瘤腸壁侵襲程度深、發生淋巴結轉移、腫瘤分化程度更低、TNM 分期更低的患者，HIF-1α 陽性率更高（均P ＜0.05），DCLK1 陽性率也更高（均P ＜0.05）。這分別與吳晨晨[15]、孟存英[17]的研究結果相符，表明兩者的陽性表達可能反映了直腸癌的惡化程度。本研究結果還表明，結直腸癌組織中HIF-1α 與DCLK1 表達呈正相關，這說明兩者均與結直腸癌的進展有關。

綜上所述，HIF-1α 和合DCLK1 在結直腸癌疾病檢測中陽性率較高，與腫瘤分期晚、淋巴結轉移等反映腫瘤惡化的臨床特征有關，且HIF-1α 與DCLK1 在結直腸癌組織中呈正關性，推測兩者均對結直腸癌的進展有推動作用。