基于數據挖掘和網絡藥理學探究含黃連方劑治療潰瘍性結腸炎的配伍規律及作用機制

王佳俊，陳青垚，王 建*，袁健梅

1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137

2.江西中醫藥大學 現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）屬于一種慢性特異性炎癥性腸病，其病變部位常始于直腸，逆行而上，可累及全結腸與末端回腸，呈連續彌漫性分布。據報道，UC 更多見于年輕群體，30～40歲的成年人是疾病發作的高峰年齡階段[1-2]。UC 無性別差異，近年來，發病率和患病率在全世界范圍呈上升趨勢，且在發達國家的發病率高于發展中國家。其發病機制復雜，涉及遺傳、環境、自身免疫和易感基因等因素，可導致腹痛、腹瀉、便血等癥狀，且具有癌變傾向并伴隨多種腸外癥狀，嚴重影響患者的生活質量，所以WHO 將其確定為現代難治疾病之一[3-4]。根據其臨床表現，UC 在中醫古籍中多被稱為腸澼、泄瀉、下痢等。如《素問·太陰陽明論》云：“故犯賊風虛邪者，陽受之……下為飧泄，久為腸澼。”《景岳全書·卷二十四·泄瀉》載：“凡《內經》有言飧泄者，有言濡泄者，皆泄瀉也；有言腸澼者，即下痢也。”對于UC 的病因病機，中醫理論認為多為外感六淫、情志失調、飲食不節等多種病因相互錯雜，損傷脾胃而致病。病程中始終存在脾虛濕聚的病機變化，因此脾腎虛衰是本病的必然轉歸，臨床上多在補脾腎的基礎上分期、分型而辨證施治[5-6]。

黃連為多年生草本植物毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.、三角葉黃連C.deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao 或云連C.teetaWall.的干燥根莖，性寒，味苦，歸心、胃、肝、大腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，常用于濕熱瀉痢、嘔吐等癥，古今均視為治痢要藥[7]。《神農本草經》記載：“黃連主熱氣，目痛，眥傷，泣出，腸澼，腹痛，下利。”《名醫別錄》強調其：“微寒，無毒。主治五藏冷熱，久下泄澼、膿血。”現代研究表明，除主要成分小檗堿外，黃連尚含黃連堿、巴馬汀、阿魏酸、綠原酸等化學成分，具有調節胃腸運動、抗潰瘍、抗炎、抗病毒等作用[8-9]。將含黃連煎劑用于治療UC患者，可通過調節神經內分泌和改善機體免疫功能，修復腸黏膜，愈合潰瘍，其抗UC 的作用機制與調節腸道菌群、降低糞中性粒細胞衍生蛋白的含量、抗氧化應激等有關[10-13]。然而目前關于黃連治療UC 的分子生物學研究尚不夠深入且缺系統性評價方法。

中醫藥數據挖掘研究是將我國豐富的中醫藥古籍和現代信息技術相結合，挖掘藥物之間的相互規律及內在聯系，是中醫藥信息發展過程中的重要內容[14-15]。2020年6月2日，習近平總書記主持召開專家學者座談會并強調“要加強古典醫籍精華的梳理和挖掘，建設一批科研支撐平臺，改革完善中藥審評審批機制，促進中藥新藥研發和產業發展。”本文以IBΜ SPSS Μodeler 18.0 關聯規則挖掘方劑數據庫，歸納黃連高頻、強相關的藥物組合；通過網絡藥理學探究高頻對藥治療UC 的潛在作用機制，并利用分子對接實現初步驗證。從“中藥-成分-疾病-靶點-組織分布-通路”角度進行分析，以期為黃連方劑加減配伍用于治療UC 的臨床實踐提供理論支撐，整體研究思路如圖1所示。

圖1 含黃連核心藥物組治療UC 的作用機制研究思路Fig.1 Research ideas on mechanism of core drug groups containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

1 材料與方法

1.1 處方數據來源

用于治療UC 的含黃連方劑來源于中國中醫科學院中醫藥信息研究所的中國方劑數據庫（http://cintmed.cintcm.com/cintmed/），該數據庫收錄從古至今的中藥方劑，時間跨度長，方劑數據可靠。

1.2 處方篩選與數據標準化

依據中醫理論對UC 病名的認識，檢索關鍵詞設定為主治“久瀉OR 腸澼OR 泄瀉OR 便血”和核心藥物“黃連”，得到方劑259 首，并進行篩選。篩選標準如下：①剔除外用方劑，僅保留內服方劑；②剔除處方藥物組成無黃連而加減方中有黃連的方劑；③剔除僅含有黃連一味藥的方劑；④剔除1911年以后的現代方劑。數據標準化處理：對于不同產地、不同炮制方法、不同入藥部位但功能一致的藥物計為同一味藥；依據《中國藥典》2020年版、《中華本草》[16]的藥物名稱進行藥名標準化處理。

1.3 數據關聯分析

利用IBΜ SPSS Μodeler 18.0軟件[17]，基于Apriori算法對已篩選的含黃連方劑進行關聯規則分析，包括支持度（support）、置信度（confidence）和提升度（lift）3 個指標，設置同時滿足支持度≥0.25，置信度≥0.9且提升度≥1 的藥對為黃連核心藥物組[18]。

1.4 中藥成分與作用靶點的篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCΜSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[19]，HERB本草組鑒（http://herb.ac.cn/）、TCΜID 數據庫（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）和近3年來的相關文獻報道以檢索相應的中藥成分。TCΜSP 上查找的中藥成分以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件篩選其對應的靶點，其他方式檢索到的中藥成分則利用Swiss Target Prediction 和SwissADΜE網站進行相應操作。利用UniPort（https://www.uniprot.org/）數據庫將靶點轉換為基因名。在GeneCard（https://www.genecards.org/）和 OΜIΜ（https://omim.org/）數據庫中，以“Ulcerative colitis”為關鍵詞搜索疾病靶點，將成分靶點與疾病靶點進行映射，獲得黃連核心藥物組治療UC 的潛在靶點。

1.5 構建與分析成分-靶點網絡圖

使用Cytoscape3.7.1 軟件[20]對構建中藥-成分-潛在靶點可視化網絡圖。

1.6 關鍵靶點提取和構建蛋白互相作用（proteinprotein interaction network，PPI）網絡

將潛在靶點導入STRING 11.0 數據庫（https://string-db.org/）[21]，物種設置為homo sapiens，以綜合得分（combined score）≥0.7 為篩選條件并刪除游離節點，得到蛋白相互作用關系，下載tsv 格式的結果文件并導入Cytoscape 3.7.1 軟件，使用該軟件中的network analyzer 進行網絡拓撲分析，以度（degree）≥2 倍中位數的靶點為關鍵靶點構建PPI 網絡。

1.7 構建潛在靶點組織分布網絡

根據HPA 數據庫（https://www.proteinatlas.org/）的tissue atlas 模塊構建靶點組織分布圖，歸納并揭示潛在靶點在人體組織中的分布。

1.8 通路富集分析

利用Μetascape（https://metascape.org/）對黃連核心藥物組潛在靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，建立中藥-成分-靶點-通路（前20 條與UC 相關）對應關系，并利用微生信網站（http://www.bioinformatics.com.cn/?p=1）進行可視化。

1.9 分子對接驗證

采用分子對接軟件AUTODOCK 4 對PPI 網絡中每味中藥對應度值最大的靶點進行分子對接驗證[22]。RCSB PDB 數據庫（http://www.rcsb.org/）[23]和ZINC數據庫（http://zinc.docking.org/）[24]被用于獲取靶蛋白和配體結構，對接結果以結合能的形式展示，分值越小說明結合越穩定。

2 結果

2.1 處方統計與分析

從中醫藥在線數據庫篩選出161 首符合要求的標準方劑，共有200 味中藥參與組方。其中使用頻數≥4 次的藥物共72 味，合計使用次數1351 次。關聯規則結果顯示含黃連方劑中高頻藥對39 對，使用頻數均≥15 次，如表1所示。72 味中藥依據《臨床中藥學》（第2 版）[25]進行分類，如表2所示。結果顯示黃連治療UC 癥狀常與補氣藥、行氣藥、清熱藥、利水滲濕藥、補血藥配伍使用，與黃連高頻配伍排名前10 味的中藥多為味甘、性溫之品；歸脾、肺2 經；療效上多可益氣健脾、行氣止痛、利水滲濕，這種用藥特點與中醫理論對“腸澼”的基本病機“脾虛濕盛”相符。

表1 治療UC 的含黃連方劑藥物之間的關聯關系Table 1 Medicines relationship between prescriptions containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

表2 治療UC 的含黃連方劑藥物類別分析Table 2 Analysis of medicine types of prescriptions containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

2.2 高頻核心藥物組

在關聯規則分析中，篩選符合“1.3”項下條件的中藥組成核心藥物組，結果與上述高頻藥物吻合，如表3所示。《得配本草》云：“白術佐川連去濕火”，《藥品經義》記載：“木香，香能通氣，和合五臟，為調諸氣要藥……同黃芩、黃連治痢疾”。當歸配伍茯苓功能補益氣血、健脾止瀉，適用于脾胃久虛、泄瀉不止。《歷代本草藥性匯解》提出甘草“性緩，善解諸急”又“補脾胃不足，能大瀉心火需用之”的觀點。故以緊密相關的6 味中藥（黃連、木香、茯苓、甘草、當歸、白術）作為黃連核心藥物組。

表3 治療UC 的含黃連方劑核心藥對Table 3 Core drug pair of prescriptions containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

2.3 成分-靶點網絡構建

根據“1.4”項下設定的條件篩選得到144 個核心藥物組的中藥成分，其中黃連、甘草、茯苓、木香、白術、當歸分別有13、98、15、8、7、12 個成分。成分靶點與疾病靶點映射得到165 個潛在靶點。使用Cytoscape 3.7.1 軟件構建疾病-中藥-成分-潛在靶點網絡圖，網絡共有1 個綠色節點（疾病），6 個青綠色節點（中藥），144 個紫色節點（成分），165個藍色節點（潛在靶點），共有2202 條邊（圖2）。

圖2 含黃連核心藥物組的成分靶點與UC 靶點的網絡分析Fig.2 Network analysis of component targets and UC targets of core drug groups containing Coptidis Rhizoma

2.4 關鍵靶點篩選和PPI 網絡構建

將自STRING11.0 網站上下載的tsv 格式文件導入Cytoscape 3.7.1 軟件中，并利用network analyzer[26]插件進行網絡拓撲學分析，網絡的平均度值為17，網絡中心性0.518，靶點度值中位數14，以度≥2倍中位數的靶點構建PPI 網絡，關鍵靶點如表4所示。網絡（圖3）中共有31 個關鍵靶點及343 條連線，顏色越紅，節點越大，靶點度值越大，即這些靶點可能與UC 具有強相關性。

表4 含黃連核心藥物組治療UC 的關鍵靶點信息Table 4 Key target information of core drug groups containing Coptis Rhizoma in treatment of UC

續表4

圖3 含黃連核心藥物組治療UC 關鍵靶點PPI 網絡Fig.3 PPI network of key target protein of core drug groups containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

2.5 潛在靶點組織分布網絡構建

在HPA 網站的tissue atlas 模塊查詢潛在靶點在人體組織中的分布，使用Cytoscape 3.7.1 軟件構建潛在靶點-組織分布網絡圖，網絡共有174 個節點和547 條邊，如圖4所示，圓形節點表示潛在靶點，箭頭節點表示組織器官，箭頭越大，顏色越深，表明該組織分布的靶點越多，顯示潛在靶點在骨髓和淋巴組織（83 個）、女性組織（74 個）、肝膽（52個）、內分泌組織（48 個）、腎臟與膀胱（43 個）高表達。

圖4 含黃連核心藥物組潛在靶點-組織分布Fig.4 Potential target-tissue distribution of core drug groups containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

2.6 KEGG 通路富集分析

利用Μetascape 網站對含黃連核心藥物組治療UC 的158 個潛在靶點進行KEGG 富集分析，設置P＜0.01，重疊值≥3，富集值≥1.5 為篩選調節，按count 值從大到小排序，前20 條通路的具體信息如圖5所示。其中近一半的通路與炎癥相關，提示含黃連核心藥物組治療UC 的分子機制可能與炎癥反應最為相關。

圖5 含黃連核心藥物組治療UC 潛在靶點的前20 條KEGG 通路Fig.5 Top 20 KEGG pathways of potential targets of core drug groups containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

2.7 網絡可視化分析

應用Cytoscape 3.7.1 軟件對158 個潛在靶點、147 個中藥成分和前20 條通路進行可視化操作，構建網絡圖，如圖6所示，由上而下的靶點分別表示中藥、成分、靶點、前20 條通路。由圖6表明含黃連核心藥物組通過多組分、多靶點、多通路發揮對UC 的治療作用。

圖6 含黃連核心藥物組治療UC 的中藥-成分-靶點-通路網絡Fig.6 TCM-component-target-pathway network of core drug groups containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

2.8 分子對接驗證

在核心藥物組眾多成分對應的靶點中，篩選出度值較大的靶點為受體，與每味藥相應成分進行分子對接驗證，分別找到6 對對接組合：小檗堿與AKT1、豆甾醇與PTGS2、槲皮素與TP53、3β-乙酞氧基蒼術酮與AR、β-谷甾醇與原癌基因JUN、常春藤皂苷元與PTGS2。以對接后配體分子與原配體分子的均方根偏差（root-mean-square deviation，RΜSD）的大小作為判斷軟件參數設置的合理性以及程序對于該蛋白受體配體復合物的適用性，一般認為該值小于0.2 時表明對接參數設置合理。以受體蛋白原配體的結合能為參照，進行靶點對接。對接結果如表5所示，結果表明受體蛋白與中藥成分的對接活性好，且與原配體的結合能相近，其中當歸中的β-谷甾醇與JUN 具有最低的結合能，分子結合模式如圖7所示。

圖7 含黃連核心藥物組潛在治療靶點與對應中藥成分對接模式Fig.7 Docking model of potential targets and corresponding ingredients of core drug groups containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

表5 含黃連核心藥物組潛在治療靶點與對應中藥成分對接結果Table 5 Molecular docking results of potential targets and corresponding ingredients of core drug group containing Coptidis Rhizoma in treatment of UC

3 討論

UC 是常見的消化系統疑難病，影響著全人類的健康。中醫認為UC 的基本病機為本虛標實證，本虛責之于脾，標實多以濕熱互結為主[27]。《醫宗金鑒》言：“瀉皆成于濕，濕皆本于脾胃。”《景岳全書》曰：“凡里急后重者……而其病本，則不在廣腸，而在脾腎”又“泄瀉之本，無不由脾胃”。并在治療總則上主張采用扶正祛邪的方法，扶正強調補脾益氣，而祛邪重在清熱燥濕[28]。

本研究利用中醫藥在線數據庫收集用于治療UC 的含黃連方劑，共收集到方劑161 首，涉及200味中藥，39 對主要藥對。與黃連配伍治療UC 的藥物多為清熱藥、補氣藥、行氣藥、利水滲濕藥及補血藥，配伍后綜合發揮利濕、健脾、行氣、止痛功效；黃連配伍清熱藥重在清熱燥濕解毒，以除UC濕熱內蘊之象，加之利水滲濕藥，以減輕水濕雍滯腸道而導致的腹痛、腹瀉樣癥狀；補氣藥、行氣藥與補血藥同用，氣血共治，在于針對UC 脾虛濕熱而導致氣血失調，濕熱搏結氣血而為便血之癥。在中藥配伍規律方面，黃連與木香、甘草、白術、當歸、茯苓之間具有強關聯性而形成重要的配伍藥對。黃連苦寒，擅長清脾胃大腸濕熱，白術功能補氣健脾而又燥濕，兩藥配伍，清熱燥濕、補氣健脾，補瀉并行；木香溫通性燥，善通行腸胃氣滯而緩解腹脹、腹痛；當歸辛溫行散，補血活血止痛，二藥配黃連，寒熱并用，起“行血則便膿自愈，調氣則后重自除”之效，而且可以兼顧濕熱壅滯腸道，耗傷陰血之慮；茯苓甘淡而利水滲濕，健脾助其運化水濕，標本兼顧；甘草為緩急止痛之品，可調和諸藥。含這6 味核心藥物治療UC 的方劑有香歸白術散、當歸芍藥湯、加味香連散等。這些核心藥物多具味甘、苦，性溫、平，主歸脾胃2 經的性能特點，其針對UC 患者脾虛、濕盛的基本病機和腹痛、便血、里急后重等臨床癥狀，而發揮補脾、補氣血而扶正，燥濕、止痛、止痢而祛邪治標，共同改善脾胃虛弱、水濕內停、瀉痢后重的UC 病證，可為其后開發用于治療UC 的新型黃連組方提供參考。

含黃連核心藥物組潛在靶點組織分布結果顯示，83 個潛在靶點在骨髓與淋巴組織中高表達。近年來研究表明，骨髓間充質干細胞定向移植在受損結腸部位可通過增加腸上皮細胞的增殖、促進腸道黏膜微環境的重建，從而使腸道恢復正常功能，且骨髓為主要造血器官，骨髓細胞的增殖可增強機體造血能力，在一定程度上改善UC 便血帶來的缺血樣癥狀。淋巴系統紊亂，即自體免疫功能失調，是UC 發病的重要機制之一。淋巴細胞在腸道系統與機體免疫系統調節中發揮著重要的媒介作用，當腸腔內細菌由于腸屏障被破壞而進入血液系統，向免疫系統傳遞傷害信號，誘導淋巴細胞釋放大量炎癥因子從而引起自身免疫反應過度，導致腸道炎癥的發生。同時，靶點多組織分布的特點，體現了機體的整體性，表明核心藥物組有治療UC 合并其他病癥的潛能。

黃連具有廣譜抗病原微生物和抗炎的藥理作用。研究報道顯示，黃連所含主要活性成分小檗堿能抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、IL-6、IL-8 等炎性因子的產生和分泌，在抗黏膜炎癥方面效果確切[29]。藥對是依據中醫配伍理論形成的2 味相對固定的藥物配對，研究相對固定的中藥配伍，可為后續方劑的開發利用提供有效的理論支撐[30]。本研究將5 組具有較強關聯的藥對設定為含黃連核心藥物組，利用網絡藥理學等研究手段，微觀探索其治療UC 的潛在分子機制。KEGG 通路富集分析顯示其涉及磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）、IL-17、晚期糖基化終產物及其受體（advanced glycation end products-receptor advanced glycation end products，AGE-RAGE）、TNF-α 等UC 相關通路。IL-17 是主要由活化的輔助性T 細胞17（T helper cell 17，Th17）產生的炎癥因子，可促進T 細胞的激活和刺激細胞黏附分子1（cellular adhesion molecule 1，ICAΜ-1），引發炎癥級聯反應[31]。研究顯示，AGE-RAGE 信號通路可通過激活PI3K-Akt 信號通路介導結腸上皮細胞遷移、增殖和凋亡[32]；在激活PI3K-Akt 通路后，磷酸化的Akt 可以通過增強人核因子κB 抑制蛋白（IκB）的磷酸化和減少IκB 的合成來激活核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）[33]。NF-κB 的活化促進了促炎細胞因子TNF-α 和IL-1β 等的表達和分泌，導致細胞因子含量失衡[34]；而TNF-α 介導的緊密連接蛋白缺陷會破環腸屏障完整性，導致一系列的炎癥反應和黏膜損傷發生[35-36]；提示UC 的發生與機體免疫反應異常引起的細胞因子表達失衡和腸屏障被破壞有關。

網絡藥理學從系統性和整體性的方向對中藥的物質基礎和作用機制展開研究，為中藥藥效成分的探索提供了新思路[37-38]。本研究構建的“中藥-成分-靶點”網絡涉及6 味中藥，137 個中藥成分以及158 個潛在靶點。分子對接驗證結果顯示黃連和甘草共有的成分槲皮素與靶蛋白的結合能較低，穩定性較好。有實驗證實，槲皮素可通過減輕腸道微血管內皮細胞中黏附分子的表達，減少腸道炎性細胞浸潤而控制腸道炎癥[39]。甘草所含的山柰酚通過核因子NF-E2 相關因子（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）途徑介導誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的產生，降低HepG2-C8 細胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RON）的含量，進而達到抗UC 作用[40]。

PPI 網絡圖表明含黃連核心藥物組治療UC 與AKT1、TP53、ΜAPK1、IL-6 和ΜAPK8 蛋白的關系較大。IL-6 是一種主要由淋巴細胞產生的多功能細胞因子，在腫瘤細胞的增殖和凋亡及細胞免疫中起著重要的作用。研究表明，阻斷該信號通路可改善小鼠實驗性結腸炎[41]。TP53 是目前與人類腫瘤相關性最高的基因，其突變常見于炎癥性腸病相關的結腸癌中，研究發現，槲皮素可通過下調ROS、COX-2 和PI3K 而減少P53 突變為TP53 的比例，從而發揮抑癌及免疫調節作用[42]。ΜAPK1 和ΜAPK8 屬于ΜAPK 家族蛋白，在基因表達調控和細胞質功能活動中發揮關鍵作用，多用于自身免疫性相關疾病中[43]。AKT1 是一種自噬相關基因，參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的細胞過程，實驗研究表明，AKT1 蛋白的泛素化可通過增強自噬作用而降低UC 小鼠炎癥因子的表達[44]。綜上所述，作用靶點可能通過降低炎癥因子表達，調節機體免疫功能維持腸道微環境的穩態從而治療UC，這也間接證明了網絡藥理學研究的可行性，是預測活性成分靶點的有力工具。

由于中藥方劑成分的多樣性，機體吸收、分布、代謝等復雜性，使得深度挖掘中藥藥效物質基礎和臨床價值成為中藥現代化的必由之路[45]。網絡藥理學從多學科的技術內容和多層次的網絡整合，探索藥物與疾病之間的潛在關系，其全面、系統的研究思想與中醫整體觀念不謀而合[46]。故本研究基于對中醫藥在線數據庫的系統篩查，歸納并總結黃連在治療UC 方面的用藥配伍規律及常用藥對，借助網絡藥理學研究策略，整合多種數據庫資料并利用分子對接軟件進行驗證，初步闡明含黃連核心藥物組多組分、多靶點的抗UC特點，揭示其與炎癥-免疫-腸屏障之間的內在聯系。但鑒于方劑配伍理論的復雜性及網絡藥理學仍處于發展的早期階段，還存在著數據庫信息收錄偏倚，如藥物成分的分離鑒定尚未區分藥用部位和非藥用部位，這可能會導致藥效成分對靶標的作用與臨床實際用藥不符而無法準確預測藥物與疾病之間的量效關系等問題；此外，在PPI 網絡的蛋白互作關系中，僅考慮度值量的大小而忽略邊的屬性，同樣會對分析結果造成影響；加之不少中藥均含槲皮素，黃連核心藥物組是否通過槲皮素作用靶點改善UC，其與小檗堿作用機制是否相同，且相關藥效成分、潛在靶點及通路等問題均有待進一步通過實驗加以驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突