載藥量對后交聯(lián)祖師麻凝膠貼膏劑流變學及體外經(jīng)皮滲透特性的影響

萬玲娟，周廣芬，王繼龍，魏舒暢*，李真真，冉 鑫，何紅杰

1.甘肅中醫(yī)藥大學甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心，甘肅 蘭州 730000

2.山東藥品食品職業(yè)學院，山東 淄博 255011

祖師麻Daphnes Giraldii Cortex始載于《陜西中藥志》[1]，具有祛風除濕、散瘀止痛之功效，臨床常用于治療風濕痹痛、關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)痛。祖師麻中的主要化學成分為香豆素類、二萜類、木脂素類等，以祖師麻甲素為代表的香豆素類具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛、抗血栓、抗凝血等藥理作用[2]。本實驗所制備的祖師麻凝膠貼膏劑（Daphnes Giraldii Cortexgel plaster，DGCGP）所用基質為一種后交聯(lián)親水性貼膏基質，該基質不含水分、載藥量大、無過敏性、可反復揭貼，由于基質交聯(lián)反應發(fā)生在制劑使用過程中，很好地克服了巴布膏生產(chǎn)時交聯(lián)速度難控制的缺點[3]。載藥量是DGCGP 成型過程中的最關鍵參數(shù)之一，決定著制劑成型工藝的成敗。本實驗在前期研究確定的基質組成基礎上，比較了不同載藥量下膠料的流變學特性變化，并采用Strat-ΜTΜ人工膜對成品貼膏進行了體外經(jīng)皮滲透特性研究，本研究結果可為后交聯(lián)祖師麻凝膠貼膏劑的載藥量確定提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀，美國沃特世公司；RYJ-12B 型藥物透皮擴散試驗儀，上海黃海藥檢儀器有限公司；LC-XTG-1000 連續(xù)式熱熔膠涂布貼合試驗機，上海立芩機械設備有限公司；NH-1D實驗用捏合機，南通福斯特機械制造有限公司；安東帕ΜCR302高級流變儀，奧地利安東帕有限公司；YP1002N 電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 材料

卡波姆940（批號20190502），廣州康喬漢普藥業(yè)有限公司；聚維酮 K90（PVP K90，批號18528456P0），德國巴斯夫化工集團有限公司；聚乙二醇400（PEG400，批號20180601）、丙二醇（批號20180510），江西益普生藥業(yè)有限公司；祖師麻流浸膏（批號20180301），甘肅泰康制藥有限責任公司。

祖師麻甲素對照品，批號110900-200405，質量分數(shù)以98.8%計，中國食品藥品檢定研究院；默克密理博Strat-ΜTΜ膜，上海必泰生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 DGCGP 膠料的制備方法

中藥浸膏的加入會嚴重影響凝膠基質的黏彈性能，加入量多則貼膏易爛膏、滲布，量少則無法保證藥效[4]。本實驗分別對載藥量為4.0%、6.8%、9.6%、12.4%（S1～S4）的膠料進行考察，以確定后交聯(lián)凝膠基質的最佳載藥量。膠料制備過程如下：準確稱取處方量的PVP K90 和卡波姆940 等以等量遞增法混勻，得固體組分；準確稱取處方量的PEG400、丙二醇和不同量祖師麻流浸膏混勻，得到一組藥量不同的液體組分。設定捏合機溫度、攪拌槳轉速及混合時間，加入液體及固體組分混合。將混合好的膠料取部分樣密封，在流變儀上測試相關參數(shù)。其余膠料經(jīng)涂布、切割制成一組含藥量不同的貼膏，密封，室溫下放置備用。

2.2 相關流變學指標的選擇

2.2.1 彈性模量（elastic modulus，G′）和黏性模量（viscosity modulus，G″） 彈性模量反映膠料的彈性特征；黏性模量反映膠料的黏性特征。

2.2.2 復合模量（complex modulus，G*） 復合模量G*＝(G′2＋G″2)1/2，表征膠料抵抗切應變的能力，能反映膠料的交聯(lián)程度、硬度及柔順性等[5-6]。

2.2.3 高頻率與低頻率下彈性模量的比值（G，G＝G′ω=100/G′ω=0.1）G值與剝離強度負相關，比值越小，剝離強度越大，膠料的黏接力越強[7-8]。貼膏貼于皮膚是一個低速的過程，此時貼膏應有一定的初黏性，低頻下具有較高G″值的貼膏，初黏力更大。

2.2.4 蠕變柔量（J(t)）及蠕變回復率（J(t)%）J(t)是與時間相關的物理常數(shù)，它能表明膠料的柔性；J(t)%表示的是回復的應變與最大應變的比值×100，反映膠料變形后的回復程度，回復率越大，貼膏皮膚追隨性越好，在使用過程中越穩(wěn)定。

2.2.5 屈服應力（yield stress，τ） 在材料拉伸或壓縮過程中，當應力達到一定值時，應力有微小的增加，而應變卻急劇增長的現(xiàn)象稱為屈服，使材料發(fā)生屈服時的正應力就是材料屈服應力[9]。

2.2.6 損耗系數(shù)（tanδ，tanδ＝G″/G′） 也稱正切損耗角，表示聚合物分子鏈段在運動時受到內摩擦力的大小[10]。

2.3 膠料的流變學特性考察

采用安東帕ΜCR302 高級流變儀，在接近人體體表溫度（32.0±0.1）℃下測試。選用轉子為PP25 SN56550，夾具間距設定為1 mm。

2.3.1 振幅掃描 動態(tài)振蕩試驗都需要在線性黏彈區(qū)（linear viscoelastic region，LVR）內進行，LVR即樣品的模量不隨剪切應力或應變的變化而改變的區(qū)域。在應變?yōu)?.01%～100%，頻率為1 Hz 的條件下，進行振幅掃描，得到圖1。從圖1可得，S2膠料的LVR 最大，說明其穩(wěn)定性最大，受到剪切時結構不易被破壞。4 種膠料LVR 的最大剪切應力值（tau）由大到小分別為S2＞S3＞S1＞S4，具體數(shù)據(jù)見表1。

圖1 振幅掃描曲線Fig.1 Amplitude sweep curve

2.3.2 頻率掃描 振蕩模式下，在LVR 內選應變（γ）為1%，角頻率（ω）為100～0.1 rad/s，進行頻率掃描，得到圖2。由圖2可知，無論是G″ω=0.1或是G′ω=100，S2 膠料的值均是最大的，說明其初黏力、剝離強度及內聚力最好。具體數(shù)據(jù)見表1。

圖2 頻率掃描曲線Fig.2 Frequency sweep curve

表1 不同載藥量膠料的tau、G＊、G″ω=0.1、G、J(t)、J(t)%及τ 值Table 1 Tau,G＊,G″ω=0.1,G,Jt,Jt% and τ values of adhesive with different drug loading

2.3.3 不同溫度下膠料tanδ值的測定 動態(tài)模式下，在固定頻率1 Hz，應變1%，溫度25～85 ℃的條件下，進行溫度掃描（圖3）。隨著溫度升高，膠料的G′和G″均不斷下降，tanδ值不斷升高，這是由于溫度升高，分子熱運動程度加劇，高分子鏈之間網(wǎng)絡結構被破壞造成的。由圖可得S2 膠料的耐溫性最好。

圖3 溫度掃描曲線Fig.3 Temperature sweep curve

2.3.4 蠕變測試 根據(jù)膠料的LVR 設定測試應力為200 Pa，施加應力時間為300 s，回復時間600 s，得到Jt隨時間的變化曲線（圖4）。S2 膠料的Jt值最小，說明其不易發(fā)生形變，保型性好；Jt%值也最大，說明其形變回復性能好，具體Jt及Jt%值如下表1所示。

圖4 蠕變柔量隨時間的變化圖Fig.4 Variation of creep compliance with time

2.3.5 旋轉模式下的τ測定τ能夠反映膠料的抗變形能力，具有較高τ值的貼膏抗變形性能更強。設剪切應力范圍為1～1000 Pa，測定τ，得到圖5，黏度（η）不再增加時對應的應力為τ。S2 膠料的τ值最大，剛性最強，具體數(shù)據(jù)見表1。

圖5 屈服應力測試曲線Fig.5 Yield stress test curve

2.4 體外透皮試驗及參數(shù)計算[11-13]

2.4.1 透皮擴散試驗用滲透介質 選擇Strat-ΜTΜ人工膜進行DGCGP 中活性成分祖師麻甲素的體外擴散試驗。

2.4.2 體外透皮吸收試驗測定 取貼膏剪成大小與供給池相同的圓片，貼于Strat-ΜTΜ膜上，將Strat-ΜTΜ膜固定于供給池與接收池之間。接收池內加入8 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液（pH 7.4），排除皮膚與接收池間的氣泡，在恒溫（32.0±0.5）℃、轉速500 r/min 下啟動并計時。在設定時間2、4、6、8、10、12、24、30、36、48 h 分別從接收池取樣2 mL，并立即補充等體積32 ℃接收液。取出樣品用0.22 μm 微孔濾膜濾過后用HPLC 法測定各時間祖師麻甲素質量濃度。

2.4.3 單位面積累積滲透量（Qn）測定 體外透皮吸收實驗結束后，按下式計算Qn。

A為有效擴散面積（2.2 cm2），V為接受室容積（8 mL），Vi為每次取樣體積，Cn為第n次取樣時接收液中的藥物質量濃度（μg/mL），Ci為第i次取樣時接收液中的藥物質量濃度（μg/mL）

以時間t（h）為橫坐標，Qn（μg/cm2）為縱坐標，制作曲線，對曲線中的直線部分進行回歸分析，得Qn-t方程，其斜率即為藥物的穩(wěn)態(tài)滲透速率［J，μg/(cm2·h)］。

2.4.4 皮膚滯留率（Qs）和累積透過率（Q）測定 體外透皮吸收實驗結束后，取下皮膚，用生理鹽水洗凈，剪碎給藥部分，加一定量的甲醇超聲后離心，取上清液，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，測定祖師麻甲素含量，按公式計算Qs；用同樣的方法處理給藥貼膏并按公式計算Q。

Qs＝V1C1/VC

Q＝AQn/VC

V1為皮膚提取液總體積，C1為皮膚提取液中祖師麻甲素的質量濃度，V為給藥貼膏提取液總體積，C為給藥貼膏提取液中祖師麻甲素的質量濃度

2.5 樣品測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Waters Symmebry-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流動相為0.1%磷酸水溶液-甲醇（68∶32）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長327 nm，進樣量20 μL。

2.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取祖師麻甲素對照品5.92 mg，置25 mL 量瓶中，加85%甲醇溶解并定容，得到祖師麻甲素對照品儲備液。

2.5.3 供試品溶液的制備 按“2.4.2”項下在設定時間取接收液2 mL，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.5.4 系統(tǒng)適用性試驗 取上述對照品及供試品溶液，按“2.5.1”項色譜條件測定，結果顯示樣品中祖師麻甲素分離度良好（圖7），與其相鄰色譜峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)以祖師麻甲素峰面積計算不低于3000。

圖7 祖師麻甲素對照品溶液 (A) 和后交聯(lián)祖師麻凝膠貼膏經(jīng)皮滲透接收液 (B) 的HPLC 圖Fig 7 HPLC of daphnetin reference substance (A) and transdermal receiving fluid post-crosslinking Daphnes Giraldii Cortex gel paster percutaneous penetration (b)

2.5.5 線性關系考察 精密吸取上述祖師麻甲素對照品儲備液，逐步稀釋成質量濃度分別為0.95、2.37、4.74、5.92、11.84、23.68 μg/mL 的對照品溶液，分別吸取10 μL，按“2.5.1”項下色譜條件進行HPLC 測定。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）作回歸曲線，得祖師麻甲素回歸方程Y＝40.965X－12.575，r＝0.999 7，祖師麻甲素在0.95～23.68 μg/mL 呈良好的線性關系。

2.5.6 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，重復進樣6 次，計算得祖師麻甲素峰面積的平均RSD值為2.13%，表明儀器精密度良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.2”項下48 h 的透皮接收液作為供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，結果峰面積的平均RSD 值為2.74%，表明該供試品溶液在室溫條件24 h 內穩(wěn)定。

2.5.8 重復性試驗 取“2.4.2”項下的透皮接收液適量共6 份，進樣測定。計算得祖師麻甲素質量濃度的平均RSD 為2.31%，表明該方法重復性良好。

2.5.9 加樣回收率試驗 取己測定的透皮接收液分別精密加入80%、100%、120%的祖師麻甲素對照品溶液，每個質量濃度制備3 份樣品，按“2.5.1”項色譜條件測定并計算回收率。結果顯示，各質量濃度的平均加樣回收率分別為96.9%、99.0%、101.3%，RSD 分別為2.47%、1.69%、2.28%。

2.6 結果分析

由表1可知，載藥量升高時，膠料的穩(wěn)定性、抗變形能力、初黏力、剝離強度及耐溫耐剪切性也會明顯提高，當載藥量達到6.8%再增加載藥量時，膠料的各項性能反而下降，故載藥量為6.8%時性能最佳。由表2可知，隨著載藥量提高，祖師麻甲素的滲透系數(shù)及累積透過率也隨之增大，載藥量為12.4%的滲透系數(shù)及累積透過率均最大；載藥量由6.8%增加至9.6%時的累積透過率變化很小，說明增大載藥量對祖師麻凝膠貼膏的經(jīng)皮滲透性沒有顯著促進作用。

表2 不同載藥量下祖師麻甲素體外經(jīng)皮滲透的動力學參數(shù) (n=3)Table 2 Kinetic parameters of daphnetin in vitro transdermal infiltration under different drug loads (n=3)

3 討論

分析流變學測試結果發(fā)現(xiàn)載藥量由4.0%增大到6.8%時，膠料性能增強，但當載藥量增加至9.6%甚至12.4%時，其性能又逐步下降。這說明提取物對后交聯(lián)凝膠貼膏的成型及性能影響顯著，分析其原因可能與提取物在凝膠性基質中的存在狀態(tài)有關。祖師麻流浸膏系用乙醇提取，其提取溶劑與后交聯(lián)凝膠貼膏基質中的液體組分PEG400、丙二醇等的溶解性能具有一定差異，因此提取物在基質中只能部分溶解，當載藥量較小時不溶部分作為填充劑又可穩(wěn)定凝膠三維網(wǎng)狀結構，改善基質性能，當載藥量太高時不溶物會減少高分子間的接觸機會使物理纏結點減少，分子鏈間易發(fā)生滑動，造成三維網(wǎng)狀結構強度減弱，性能下降。

Dahlquist 的黏性標準提出[14]，J(t)＞10-5Pa-1的膠黏劑樣品顯示出了適當?shù)募羟袕姸刃阅埽緦嶒濲(t)值均在10-5Pa-1以上，說明利用該基質制成的貼膏具有良好的皮膚追隨性，不會溢邊和漏膏。沈瑞雪等[15]認為，G值應較高，以5＜G＜300 為宜，4批膠料均在范圍內；G′值應小于3.3×105Pa，否則黏結性就會消失，本實驗中G′值最大為14 547 Pa，符合要求。以上均說明該基質對乙醇提取物有較強的載藥能力，最大載藥量可達12.4%。但由透皮結果可知就祖師麻而言載藥量過大會造成原料藥浪費，故以6.8%為最佳。

分析體外透皮實驗結果，本實驗測定了DGCGP 48 h 內的經(jīng)皮滲透情況（圖6），前12 h 內祖師麻甲素的透皮速率較緩，12 h 后則以較高的速率恒速透過皮膚。表明后交聯(lián)凝膠貼膏基質在12～48 h 內有很好的釋藥性能，且后交聯(lián)凝膠貼膏基質吸汗透氣，不妨礙皮膚生理功能，可長時間貼敷，利用該基質有利于將祖師麻開發(fā)為長效外用制劑。載藥量與貼膏膠料中的濃度正相關，載藥量太低會造成藥物透皮速率及釋藥時間不足，載藥量過高會影響貼膏性能。本實驗載藥量由4.0%增加到12.4%時，皮膚滯留率相差不大，但藥物的累積透過率僅增加了1.4倍，增大載藥量的透皮效果并不顯著，綜合流變學及透皮測試結果，確定最佳載藥量為6.8%。

圖6 不同載藥量下祖師麻甲素的經(jīng)皮滲透曲線Fig.6 Percutaneous permeability curve of daphnetin under different drug loading

祖師麻甲素為香豆素類化合物極性相對較小，親脂性基質對其有較強的滯留作用，釋放能力有限，因此已有文獻對親脂性基質制成的制劑進行透皮特性考察時都使用含有機溶劑的接收液[16]。但含有機溶劑的接受液實驗結果的與實際透皮情況相差甚遠。本實驗所用后交聯(lián)親水凝膠作為基質與祖師麻甲素極性相差較大，用PBS 溶液作為接收液即可獲得較好的透皮效果，結果更具參考價值。

文獻表明，皮膚滲透性大小依次為大鼠皮膚＞豬皮膚＞人皮膚[17]，豬皮比鼠皮更接近人的皮膚，但不易獲得，鼠皮存在批次間差異。本實驗選Strat-ΜTΜ膜作為滲透介質，與各種動物皮膚相比，這種人造膜的皮膚滲透性更接近人的皮膚（R2＝0.99）[18]，所得結果更具有可靠性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突