青龍衣化學成分的分離及其體外抗腫瘤活性的研究

柴麗華，宋海龍，馬曉玲，陳 剛，石磊嶺*，魏鴻雁*

1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046

2.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002

青龍衣是胡桃科（Juglandaceae）植物落葉喬木核桃楸Juglans mandshuricaΜaxim.未成熟果實的青色外果皮，又被稱為核桃青皮，始載于《開元本草》，其鎮痛、治瘍功效在《山東中草藥手冊》《救急方》等醫藥典籍中早有記載，民間也有將其泡水飲用起止痛之效的應用。現代研究表明，青龍衣中含有豐富的化學成分，包括醌類、黃酮類、二芳基庚烷類、酚酸類等[1]，具有良好的抗菌、抗腫瘤、鎮痛等多種藥理活性[2-3]。為了進一步探究青龍衣中的活性物質基礎，本實驗通過硅膠柱色譜、反相C18柱色譜、ΜCI 中壓色譜結合制備型高效液相色譜儀對青龍衣提取物二氯甲烷萃取部位進行了分離純化，分別鑒定了12 個化合物：5,5′-dimethoxybiphenyl-2,2′-diol（1）、4,17-dimethoxy-2-oxatricyclo [13.2.2.13,7]eicosa-3,5,7(20),15,17,18-hexaene-10,16-diol（2）、3-羥基-1-(3-甲氧基-4-羥基-苯基)-丙基-1-酮 [3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) propan-1-one，3]、4 羥基-3,5-二甲基苯甲酸（4-hydroxy-3,5-dimethoxy-benzoic acid，4）、(4S)-4-羥基-1-四氫萘酮 [(4S)-4-hydroxy-1-tetralone，5]、(4R)-Omethylsclerone（6）、阿魏酸（ferulic acid，7）、(4S)-4,5,8-trihydroxy-α-tetralon（8）、5,8-二羥基-4-甲氧基-α-四氫萘酮（5,8-dihydroxy-4-methoxy-αtetralone，9）、4-megastigmen-3,9-dione（10）、3,4′-dihydroxy-3′-methoxybenzenepen tanoic acid（11）、vomifoliol（12）。其中化合物1～3、6、10～11 首次從青龍衣中得到，且化合物2、6、8、9 為青龍衣中特有成分。采用ΜTT 法對12 個化合物進行體外抑制腫瘤細胞試驗，結果表明，化合物1、3、6、8～11 對3 種不同腫瘤細胞表現出不同的抑制活性。

1 儀器與材料

Bruker Avance III 600 型核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司），賽默飛世LTQ-Obitrap XL 液質聯用儀（Thermo Fisher 公司），制備型Aglient 高效液相色譜儀（美國Aglient 公司），柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司），薄層色譜用硅膠G、H、GF254，ΜCI（日本三菱化學公司），常規試劑均為分析純。

青龍衣采購于新疆和田藥材市場，經新疆中藥民族藥研究所賈曉光研究員鑒定為核桃楸J.mandshuricaΜaxim.未成熟果實的干燥外果皮。

2 提取與分離

干燥青龍衣10 kg，粉碎，用95%甲醇熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏1075 g。總浸膏用水分散，依次用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇進行萃取，萃取液減壓濃縮至干，得到石油醚部位浸膏185 g、二氯甲烷部位浸膏260 g、醋酸乙酯部位浸膏168 g、正丁醇部位浸膏287 g。

取二氯甲烷部位浸膏經過硅膠（100～200 目）柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯（10∶1→0∶1）梯度洗脫，薄層色譜檢測，合并相似洗脫液得到4 個流分Fr.A～D。Fr.B（100 g）經硅膠（100～200目）柱色譜進一步分離，石油醚-二氯甲烷（1∶10→0∶1）梯度洗脫，得到4 個流分Fr.B-I～B-Ⅳ。Fr.B-I（20.0 g）經反復硅膠柱色譜分離，石油醚-二氯甲烷（1∶8→0∶1）梯度洗脫，得到4 個部位Fr.B-Ⅰ-1～B-I-4。Fr.B-I-1（3.0 g）過ΜCI 中壓色譜，30%～100%甲醇梯度洗脫，得到6 個組分Fr.B-I-1a～B-I-1f。Fr.B-I-1d 經制備型HPLC（甲醇-水65∶35）制備得到化合物2（2.2 mg）。Fr.B-I-2（1.8 g）進行反相C18柱色譜分離，30%～100%甲醇梯度洗脫，得到7 個組分Fr.B-I-2a～B-I-2g。Fr.B-I-2a 經制備型HPLC（甲醇-水28∶72）制備得到化合物3（6.1 mg）、4（35.3 mg）、5（20.3 mg）。Fr.B-I-2b 經制備型HPLC（甲醇-水48∶52）制備得到化合物1（3.9 mg）。Fr.B-I-3（0.9 g）進行反相C18柱色譜分離，30%～100%甲醇梯度洗脫，得到5 個組分Fr.B-I-3a～B-I-3e。Fr.B-I-3a 經制備型HPLC（甲醇-水38∶62）制備得到化合物6（3.4 mg）、7（6.4 mg）。Fr.B-I-3c 經制備型HPLC（乙腈-水38∶62）制備得到化合物11（2.7 mg）。Fr.B-I-4（2.2 g）進行反相C18柱色譜分離，30%～100%甲醇梯度洗脫，得到8 個組分：Fr.B-I-4b 經制備型HPLC（甲醇-水40∶60）制備得到化合物8（17.5 mg）、9（3.8 mg）、12（3.2 mg）。Fr.B-I-4c 經制備型HPLC（乙腈-水30∶70）制備得到化合物10（2.5 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：無色油狀物。ESI-ΜSm/z:269 [Μ＋Na]+（計算值269，C14H14O4Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR(600 ΜHz,CD3OD)δ:6.64 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3,3′),6.69 (2H,d,J=8.4 Hz,H-4,4′),6.99 (2H,s,H-6,6′),3.71 (6H,s,5,5′-OCH3)；13C-NΜR (150 ΜHz,CD3OD)δ:128.2 (C-1,1′),150.6 (C-2,2′),116.6(C-3,3′),124.2 (C-4,4′),149.5 (C-5,5′),111.8 (C-6,6′),56.6 (5,5′-OCH3)。以上數據與文獻報道的基本一致[4]，故鑒定化合物1 為5,5′-dimethoxybiphenyl-2,2′-diol。

化合物2：無色粉末（甲醇）。ESI-ΜSm/z:381[Μ＋Na]+（計算值381，C21H26O5Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR (600 ΜHz,CD3OD)δ:6.88 (1H,d,J=7.8 Hz,H-3),6.66 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-4),5.70(1H,d,J=1.8 Hz,H-6),3.15 (1H,m,H-9),6.60 (1H,d,J=8.4 Hz,H-18),6.91 (1H,d,J=7.8 Hz,H-19)；13C-NΜR (150 ΜHz,CD3OD)δ:147.8 (C-1),142.7(C-2),150.9 (C-3),125.6 (C-4),126.7 (C-5),115.1(C-6),29.4 (C-7),28.2 (C-8),23.7 (C-9),37.4 (C-10),72.7 (C-11),35.9 (C-12),28.1 (C-13),135.5 (C-14),113.9 (C-15),151.3 (C-16),148.5 (C-17),109.0(C-18),121.7 (C-19),61.9 (2-OCH3),57.0 (16-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致[5]，故鑒定化合物2為4,17-dimethoxy-2-oxatricyclo[13.2.2.13,7]eicosa-3,5,7(20),15,17,18-hexaene-10,16-diol。

化合物3：黃色油狀物。ESI-ΜSm/z:219 [Μ＋Na]+（計算值219，C10H12O4Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR(600 ΜHz,CD3OD)δ:7.55 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.87 (1H,d,J=7.8 Hz,H-5),7.59 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-6),3.18 (2H,t,J=6.0 Hz,H-8),3.95 (2H,t,J=6.0 Hz,H-9),3.91 (3H,s,3-OCH3)；13C-NΜR(150 ΜHz,CD3OD)δ:130.8 (C-1),113.9 (C-2),149.3(C-3),153.5 (C-4),116.0 (C-5),124.9 (C-6),199.9(C-7),42.7 (C-8),59.1 (C-9),56.5 (3-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致[6]，故鑒定化合物3 為3-羥基-1-(3-甲氧基-4-羥基-苯基)-丙基-1-酮。

化合物4：淡黃色粉末（甲醇）。ESI-ΜSm/z:221[Μ＋Na]+（計算值221，C9H10O5Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR (600 ΜHz,CD3OD)δ:7.32 (2H,s,H-2,6),3.87 (6H,s,3,5-OCH3)；13C-NΜR (150 ΜHz,CD3OD)δ:122.1 (C-1),108.4 (C-2,6),148.9 (C-3,5),141.8(C-4),56.9 (3,5-OCH3)。以上數據與文獻報道的基本一致[7]，故鑒定化合物4 為4 羥基-3,5-二甲基苯甲酸。

化合物5：黃色油狀物。ESI-ΜSm/z:185 [Μ＋Na]+（計算值185，C10H10O2Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR(600 ΜHz,CD3OD)δ:4.92 (1H,dd,J=10.4,3.6 Hz,H-4),7.65 (2H,m,H-5,6),7.42 (1H,m,H-7),7.95(1H,d,J=7.8 Hz,H-8)；13C-NΜR (150 ΜHz,CD3OD)δ:200.1 (C-1),36.5 (C-2),33.3 (C-3),68.4(C-4),148.1 (C-4a),127.8 (C-5),135.4 (C-6),128.7(C-7),129.2 (C-8),132.5 (C-8a)。以上數據與文獻報道的基本一致[8-9]，故鑒定化合物5 為 (4S)-4-羥基-1-四氫萘酮。

化合物6：黃色油狀物。ESI-ΜSm/z:216 [Μ＋Na]+（計算值216，C11H12O3Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR(600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:5.11 (1H,t,J=3.6 Hz,H-4),7.09 (1H,dd,J=7.8,1.2 Hz,H-6),7.24 (1H,t,J=7.8 Hz,H-7),7.32 (1H,dd,J=7.8,1.2 Hz,H-8),3.79 (3H,s,5-OCH3) ；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:197.9 (C-1),32.9 (C-2),30.4 (C-3),59.8(C-4),131.3 (C-4a),155.4 (C-5),116.5 (C-6),128.5(C-7),120.5 (C-8),132.4 (C-8a),55.9 (5-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致[10]，故鑒定化合物6 為(4R)-O-methylsclerone。

化合物7：白色結晶（甲醇）。mp 169～171 ℃。ESI-ΜSm/z:217 [Μ ＋Na]+，（計算值217，C10H10O4Na [Μ ＋Na]+）。1H-NΜR (600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:7.28 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2),6.79 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5),7.078 (1H,dd,J=8.4,1.8 Hz,H-6),7.49 (1H,d,J=16.2 Hz,H-7),6.38 (1H,d,J=16.2 Hz,H-8),3.81 (3H,s,3-OCH3)；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:124.7 (C-1),115.8 (C-2),149.1 (C-3),147.9 (C-4),115.5 (C-5),122.8 (C-6),144.4 (C-7),111.1(C-8),168.1 (COOH),55.7 (3-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致[11]，故鑒定化合物7 為阿魏酸。

化合物8：淡黃色粉末（甲醇）。ESI-ΜSm/z:217[Μ＋Na]+（計算值217，C10H10O4Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR (600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:5.07 (1H,s,H-4),7.10 (1H,d,J=9.0 Hz,H-6),6.76 (1H,d,J=9.0 Hz,H-7)；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:205.8 (C-1),32.8 (C-2),30.4 (C-3),59.6 (C-4),129.3 (C-4a),146.7(C-5),125.6 (C-6),116.9 (C-7),154.5 (C-8),115.2(C-8a)。以上數據與文獻報道基本一致[12]，故鑒定化合物8 為 (4S)-4,5,8-trihydroxy-α-tetralone。

化合物9：淡黃色粉末（甲醇）。ESI-ΜSm/z:231[Μ＋Na]+（計算值231，C11H12O4Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR (600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:4.76 (1H,m,H-4),7.15 (1H,d,J=9.0 Hz,H-6),6.81 (1H,d,J=9.0 Hz,H-7),3.34 (3H,s,4-OCH3)；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:205.5 (C-1),32.5 (C-2),26.2 (C-3),67.9(C-4),147.0 (C-5),125.5 (C-5a),126.4 (C-6),117.8(C-7),154.7 (C-8),115.3 (C-8a),56.1 (4-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致[13]，故鑒定化合物9 為5,8-二羥基-4-甲氧基-α-四氫萘酮。

化合物10：無色油狀物。ESI-ΜSm/z:231 [Μ＋Na]+（計算值231，C13H20O2Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR(600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:5.73 (1H,s,H-4),1.91 (1H,t,J=5.4 Hz,H-6),2.09 (3H,s,10-CH3),0.93 (3H,s,11-CH3),0.99 (3H,s,12-CH3),1.96 (3H,s,13-CH3)；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:41.9 (C-1),46.8(C-2),197.9 (C-3),124.5 (C-4),165.3 (C-5),49.3(C-6),24.0 (C-7),35.9 (C-8),208.0 (C-9),29.9(C-10),28.4 (C-11),26.7 (C-12),22.9 (C-13)。以上數據與文獻報道基本一致[14]，故鑒定化合物10 為(6R,7E)-4,7-megastigmadien-3,9-dione。

化合物11：黃色油狀物。ESI-ΜSm/z:263 [Μ＋Na]+（計算值263，C12H16O5Na [Μ＋Na]+）。1H-NΜR(600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:1.59 (1H,m,H-4),6.71 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),6.65 (1H,d,J=7.8 Hz,H-5′),5.55 (1H,dd,J=7.8,1.8 Hz,H-6′),3.72 (3H,s,3′-OCH3)；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:179.2(COOH),43.8 (C-2),69.0 (C-3),40.0 (C-4),31.5(C-5),133.3 (C-1′),112.4 (C-2′),147.3 (C-3′),144.3(C-4′),115.2 (C-5′),120.3 (C-6′),55.5 (3′-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致[15]，故鑒定化合物11為3,4′-dihydroxy-3′-methoxy benzenepentanoic acid。

化合物12：白色粉末（甲醇）。ESI-ΜSm/z:256[Μ＋Na]+（計算值256，C13H20O3Na [Μ＋Na]+）。1HNΜR (600 ΜHz,DΜSO-d6)δ:5.89 (1H,d,J=3.0 Hz,H-5),6.29 (1H,d,J=15.6 Hz,H-7),6.99 (1H,d,J=15.6 Hz,H-8),4.24 (1H,m,H-9),1.00 (3H,s,H-10),0.91 (3H,s,H-11),0.94 (3H,s,H-12),1.57(3H,s,H-13)；13C-NΜR (150 ΜHz,DΜSO-d6)δ:78.6 (C-1),43.2 (C-2),49.2 (C-3),189.0 (C-4),126.6(C-5),162.3 (C-6),130.6 (C-7),139.2 (C-8),63.7(C-9),23.8 (C-10),24.2 (C-11),23.3 (C-12),22.3(C-13)。以上數據與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物12 為vomifoliol。

4 體外抗腫瘤活性篩選

采用ΜTT 比色法測試化合物1～12 的體外抑制子宮頸癌Hela 細胞、人胃癌HGC-27 細胞以及結腸癌Ht-29 細胞的活性[17-18]。以化合物1～12 為實驗組，順鉑為陽性對照組，同時設立空白組。

培養基稀釋后，將HeLa、HGC-27 以及Ht-29細胞以6×104/mL 的密度接種于96 孔板，每孔100 μL，CO2培養箱中正常培養24 h 后，各組加入相對應的藥物，設置5 個濃度，每個濃度3 個復孔；培養48 h 后，于每孔加ΜTT 10 μL 染色；繼續培養4 h 后，吸棄原培養液，每孔加入DΜSO 100 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，并于酶聯免疫檢測儀570 nm 波長處檢測吸光度（A）值，根據A值計算化合物的半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），結果見表1。

表1 化合物1、3、6、8～11 分別對HeLa、HGC-27、Ht-29細胞的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of compounds 1,3,6 and 8—11 on cell lines HeLa,HGC-27 and Ht-29,respectively

實驗結果顯示結果表明化合物6、10 對3 種細胞均有良好的抑制作用，化合物6 對3 種腫瘤細胞的抑制效果接近順鉑。化合物3 對Ht-29 細胞的抑制活性優于順鉑；化合物9 對Hela 細胞有明顯抑制作用；化合物1、8、11 對3 種腫瘤細胞則表現出不同較弱的抑制活性。

5 討論

本實驗從青龍衣95%甲醇提取物的二氯甲烷萃取部位中分離得到了12 個化合物，并對其進行了體外抗腫瘤活性試驗，結果表明青龍衣中的特有成分化合物6，以及化合物10 對子宮頸癌細胞株Hela、人胃癌細胞株HGC-27 以及結腸癌細胞株Ht-29 均具有較好的體外抑制作用，化合物3 對Ht-29 細胞表現出顯著的抑制活性，說明化合物3、6 和10 具有進一步開發抗腫瘤新藥的潛力。本實驗為探究青龍衣中的活性物質基礎提供了理論依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突