姜黃中1個新的裂環沒藥烷型倍半萜成分

郭玉勤，舒洪珍，譙明鳴，彭 成，劉 菲*，熊 亮*

1.成都中醫藥大學藥學院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

2.成都中醫藥大學，西南特色藥材創新藥物成分研究所，四川 成都 611137

姜黃Curcuma longaL.，又名寶鼎香、黃姜、毛姜黃等，姜科（Zingiberaceae）姜黃屬草本植物，生于海拔800 m 以下的低山、丘陵、平壩。主要分布于我國四川、福建、廣西、云南、臺灣等地，是著名的川產道地藥材[1-2]。姜黃作為傳統的藥食兩用植物，已有5 千多年的應用歷史，在許多國家長期被用作草藥、香料和膳食補充劑[3-4]，具有破血行氣、通經止痛的功效。現代醫學常用于治療痛經、月經不調、動脈粥樣硬化、高脂血癥、高血壓、糖尿病等疾病[5-6]。化學研究表明，姜黃中主要含姜黃素類、萜類以及其他成分，其中萜類又以倍半萜類成分為代表。目前，從姜黃中鑒定的倍半萜類化合物多達100 多個，結構類型主要包括沒藥烷型、愈創木烷型、吉瑪烷型、桉葉烷型、長松針烷型、杜松烷型、檀香烷型、欖香烷型、蒈烷型、蒼耳烷型、菖蒲烷型、柏木烷型等[7-11]，其中沒藥烷型倍半萜含量最為豐富。課題組前期分離鑒定了多個倍半萜并發現這些成分具有顯著的舒張血管活性[12-14]，為了進一步研究姜黃的化學成分及其活性，本研究運用多種色譜和波譜技術分離純化姜黃中的倍半萜類成分，得到1 個新的裂環沒藥烷型倍半萜成分，命名為姜黃烷G（curcumane G，1）。對分離得到的化合物進行舒張血管活性評價，結果顯示化合物1 無顯著舒張血管作用。

1 材料

1.1 儀器與試劑

Bruker-700 核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；Agilent 6230 LC/TOF 高分辨質譜儀（美國Agilent 公司）；安東帕ΜCP 200 旋光儀（美國安東帕有限公司）；圓二色譜儀（英國Chirascan-plus CD光譜儀）；紅外光譜儀（美國Agilent 公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；中壓液相色譜儀（瑞士Búchi Gradient Former B-687）；旋轉蒸發儀（亞榮生化儀器）；Zorbax SB-C18（250 mm×9.4 mm，5 μm）色譜柱（美國Agilent 公司）；薄層色譜硅膠GF254（青島海洋化工廠）；柱色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（瑞典Amershan Pharmacia 公司）；電子天平（德國Sartorius BP221S）；離體組織器官恒溫灌流系統（澳大利亞PL3508B6/C-V Panlab 8 Chamber Organ Bath System）；可調式移液器（美國 Thermo Fisher Scinentific）；甲醇（色譜級，美國Tedia 公司）；乙醇（色譜級，美國Fisher 公司）；其他所用試劑均為分析純（成都市科隆化學品有限公司）。

1.2 實驗動物

SD 大鼠，清潔級，雄鼠，體質量（200±20）g，由成都中醫藥大學實驗動物研究中心提供。動物生產許可證號：SCXK（川）2020-030，檢疫后用。飼養溫度21～27 ℃，濕度（50±5）%，晝夜光照及通風環境自然調節。動物實驗經成都中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核（備案編號為2020-04），均符合3R 原則。

1.3 藥材

姜黃飲片購于四川新荷花中藥飲片有限公司，經成都中醫藥大學藥用植物研究室李敏教授鑒定為姜黃Curcuma longaL.的干燥根莖。姜黃飲片標本（CL-20160803）保存于成都中醫藥大學西南特色藥材創新藥物成分研究所。

2 方法

2.1 提取與分離

姜黃藥材飲片（50 kg），加95%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取3 次，每次8 倍量溶劑，第1 次3 h、第2 次2 h、第3 次1.5 h，合并提取液，50 ℃減壓濃縮得半固體流浸膏7 kg。將浸膏混懸于水中，依次以石油醚、醋酸乙酯反復萃取并將萃取液于50 ℃減壓濃縮，得石油醚部位2 kg，醋酸乙酯部位3 kg。醋酸乙酯部位經硅膠柱色譜（150 cm×22 cm）分離，石油醚-醋酸乙酯系統（1∶0、7∶3、4∶6、0∶1）洗脫，洗脫液經薄層色譜檢測，合并組成相似的組分，減壓濃縮至稠浸膏，并依次編號為A～F。浸膏B（500 g）經硅膠柱色譜（150 cm×22 cm）分離，用二氯甲烷-醋酸乙酯系統（100∶1→0∶1）梯度洗脫，洗脫液經薄層色譜法檢視，合并相似洗脫組分并減壓濃縮，得16 個流分Fr.1～16。Fr.5進一步經中壓液相色譜（30 cm×4 cm）分離，以甲醇-水系統（10%→100%）梯度洗脫，得到10 個流分Fr.5-1～5-10。Fr.5-1 經過凝膠色譜柱分離，石油醚-二氯甲烷-甲醇（2∶2∶1）洗脫，得到5 個流分Fr.5-1-1～5-1-5）。Fr.5-1-5 經硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（200∶1→1∶1）梯度洗脫，得到5 個流分Fr.5-1-5-1～5-1-5-5。Fr.5-1-5-3 依次經過制備薄層色譜（石油醚-醋酸乙酯2∶3）和反相半制備高效液相色譜（60%甲醇）分離得到化合物1（6 mg，tR＝28 min，1 mL/min）。

2.2 活性測定

2.2.1 溶液的配制 K-H 液（Kreb’-Henseleit solution）配制：NaCl 13.87 g；KCl 0.7 g；KH2PO40.32 g；ΜgSO40.28 g；NaHCO34.2 g；Glucose 3.64 g；EDTA 0.018 g；CaCl20.56 g；加超純水至2 L，pH值7.4，現配現用。

樣品溶液的配制：精密稱取化合物1 適量，加二甲基亞砜配制成50 μmol/mL 的母液，備用。

2.2.2 大鼠胸主動脈血管環的制備 頸椎脫臼處死SD 大鼠，取出胸主動脈，置于預冷卻的K-H 液中，剔除血管周圍的脂肪和結締組織后，將其剪成4 個3～5 mm 的血管環，分別將血管環固定于4 個裝有20 mL K-H 液的浴槽內（恒溫37 ℃，持續通95%O2＋5% CO2混合氣體），采用離體組織灌流模型和Power Lab 數據分析系統記錄離體血管環張力的變化。保持血管環起始張力為1.0 g 的狀態下，每15 min 換1 次K-H 液，待血管環平衡60 min 后，用60 mmol/L 的KCl 連續刺激血管環至少2～3 次。每次刺激后，使用K-H 液連續沖洗3 次，每次5 min，待血管環張力恢復至基礎狀態后，穩定30 min。當連續相同刺激所引起的血管收縮幅度小于10%時，往浴槽內加入60 mmol/L 的KCl 預收縮胸主動脈環，待血管收縮張力達到平臺期時，累積加入5 個濃度（0.25、0.75、2.50、7.50、25.00 μmol/L）的樣品溶液，觀察濃度與舒張效應曲線，比較不同濃度下化合物對KCl（60 mmol/L）預收縮血管環的舒張作用。

3 結構鑒定

化合物1：無色油狀液體，易溶于甲醇、丙酮等有機溶劑。[α]25D＋20.6 (c0.06,ΜeOH)。其質譜數據 (＋)-HR-ESI-ΜSm/z:289.141 4 [Μ＋Na]+（計算值C15H22O4Na,289.141 6）,提示該化合物分子式為C15H22O4，不飽和度為5。UV 光譜顯示其在238 nm處有最大吸收，且IR 光譜中顯示1684 cm-1的吸收帶，提示其可能含有α,β 不飽和酮等官能團[15-16]。1H-NΜR（表1）顯示該化合物結構中含有1 個烯氫信號 [δH6.16 (1H,brs)]、3 個單峰甲基信號 [δH2.16(3H,s),1.87 (3H,brs),2.10 (3H,brs)]和1 個雙峰甲基信號 [δH0.91 (3H,d,J=7.0 Hz)]。13C-NΜR 和DEPT 譜顯示該化合物共有15 個碳信號，可歸屬為4 個甲基碳、3 個亞甲基碳、4 個次甲基碳 [包含1個連氧叔碳 (δC79.5) 和1 個烯碳 (δC124.8)]和5個季碳 [包含2 個酮羰基碳 (δC205.4,199.6)、1 個酯羰基碳 (δC176.3) 以及1 個雙鍵季碳 (δC155.2)]信號。與文獻對比發現，化合物1 的核磁數據與已知化合物3,4-seco-bisabol-10-ene-3-one-1,4-olide[17]的數據類似，區別在于化合物1 的C-9 被氧化為羰基 (δC199.6)，因此，推斷化合物1 為裂環沒藥烷型倍半萜。為了進一步確定化合物1 的結構，進行了2D NΜR 實驗。HΜBC 譜和1H-1H COSY 譜顯示的主要相關信號如圖1所示，尤其是在HΜBC譜中，H-7、H2-8、H-10 同時與C-9 (δC199.6) 相關確證了C-9 為羰基，且與雙鍵Δ10(11)共軛，化合物1 的平面結構得以確定。

圖1 化合物1 的結構及主要HMBC、1H-1H COSY 和NOESY 信號Fig.1 Structure and key correlations of HMBC,1H-1H COSY and NOESY of compound 1

表1 化合物1 的1H-(700 MHz,acetone-d6) 和13C-NMR數據 (175 MHz,acetone-d6)Table 1 1H-(700 MHz,acetone-d6) and 13C-NMR (175 MHz,acetone-d6) data of compound 1

進一步通過分析NOSEY 譜和比較核磁數據理論值與計算值確定其相對構型。在NOSEY 譜中，H2-2 與H-6 相關說明H-1 與H-6 位于異側，而Μe-7處于支鏈上，無法通過NOSEY 實驗確定其相對構型，因此，化合物1 的構型存在4 種可能，即(1S,6S,7S)/(1R,6R,7R)和 (1S,6S,7R)/(1R,6R,7S)。為進一步確定其相對構型，分別對(1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1和(1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 的核磁數據進行計算。計算結果表明(1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1 和(1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 的13C-NΜR 化學位移計算值（y）與實驗值（x）的相關系數（R2）差異不大 [R2(1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1:0.998 5；(1S,6S,7R)-1/ (1R,6R,7S)-1:0.998 0；圖2-A、B]，相比之下DP4+概率分析對于異構體的區分更具優勢[18]，基于1H-和13C-NΜR 數據的DP4+概率分析（圖2-C）顯示(1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 明顯優于(1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1。進一步通過計算ECD 確定化合物1 的絕對構型，使用Conflex 軟件對(1S,6S,7R)-1 進行優勢構象搜索，得到了11 個構象（Boltzmann distribution≥1%）。利用 Gaussian6.0 軟件，根據密度泛函數理論（DFT），采用密度泛函B3LYP 方法在6-31G 基組水平于空氣中對所選構象進行優化，再將優化后的構象采用密度泛函ω-B97XD 方法在DGDZVP 基組水平，于IEFPCΜ 模型在乙腈中再次優化，隨后，優化的構象于密度泛函CAΜ-B3LYP 方法在DGDZVP 基組水平，于IEFPCΜ 模型在乙腈中計算ECD 圖譜[12]。最后，使用SpecDis1.71 軟件打開化合物1 上述構象的ECD 圖譜，根據每個構象的玻爾茲曼能量分布進行擬合，生成了(1S,6S,7R)-1 和(1R,6R,7S)-1 的計算ECD 譜（σ＝0.3 eV，UV 位移＋13 nm）如圖3所示。結果表明，在200～340 nm，理論計算的 (1S,6S,7R)-1 ECD 譜與實測ECD 譜非常吻合。因此，化合物1 的絕對構型確定為 1S,6S,7R，化合物 1 鑒定為(1S,6S,7R)-3,4-裂環沒藥烷-10-烯-3,9-二酮-1,4-內酯。

圖2 (1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1 (A) 和 (1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 (B) 在PCM-mPW191/6-331＋G (d,p) 水平上的13C-NMR 化學位移的回歸分析及DP4＋概率 (C)Fig.2 Regression analysis of experimental and calculated 13C-NMR chemical shifts of (1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1 (A) and (1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 (B) at PCM-mPW1PW91/ 6-311＋G (d,p) level (acetone-d6);and DP4＋probability for (1S,6S,7S)-1/(1R,6R,7R)-1 and(1S,6S,7R)-1/(1R,6R,7S)-1 at PCM-mPW1PW91/6-311＋G (d,p) level (C)

圖3 化合物1 的實測ECD 譜和計算ECD 譜Fig.3 Experimental and calculated ECD spectra of compound 1

4 舒張血管活性評價

中醫藥治療心血管疾病具有安全性高、穩定性好、療效顯著的優點，主要表現在舒張血管、抗氧化、抗凝血、調血脂、增加血流量和心肌細胞保護等方面。現代藥理研究表明，姜黃具有舒張血管、抗凝血、改善血液流變學和血流動力學等作用，可用于心血管疾病的治療[19-22]。課題組前期發現姜黃中的沒藥烷型倍半萜類成分具有良好的舒張血管作用[12-14]，因此本實驗測定了化合物1對KCl預收縮的胸主動脈環舒張作用，但結果顯示該化合物無明顯活性。

5 討論

本實驗運用多種色譜分離技術從姜黃95%乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位中獲得1 個新的裂環沒藥烷型倍半萜（1），并通過NOESY 和計算NΜR 確定其相對構型，計算ECD 確定其絕對構型。姜黃中含有較多的沒藥烷型倍半萜，但裂環沒藥烷型倍半萜較為少見，而且這類裂環沒藥烷型倍半萜在自然界中較為罕見，目前僅在姜科中分離得到[17]。化合物1 在沒藥烷型骨架的基礎上，C-4-C-3 經氧化斷鍵而開環，并形成丁內酯結構，而其他裂環沒藥烷型倍半萜的裂環位置通常在C-2 與C-3 之間[20]。盡管課題組前期發現姜黃倍半萜成分具有顯著的舒張血管作用，但化合物1 對KCl 預收縮的胸主動脈環無明顯活性。因此猜測裂環沒藥烷型倍半萜結構中的裂環對其舒張血管活性可能產生影響。本研究豐富了姜黃的化學成分，為姜黃倍半萜類成分的后續研究提供了參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突