MTHFRC677T與PAI-14G/5G基因多態性與缺血性腦卒中發生風險的相關性研究

韓欣汝 尹雁惠 王倩 于克煒 張翔

濟南市中心醫院臨床藥學科 250013

腦卒中是由多種因素誘發的腦內動脈狹窄、閉塞或破裂，進而造成急性腦血液循環障礙，臨床表現為一次性或永久性腦功能障礙，具有高發病率、病死率、致殘率和并發癥多等特點，是全球第二大死亡原因［1］。《中國腦卒中防治報告（2019）》發布腦卒中是國人疾病所致壽命損失年的第1位病因。全球疾病負擔研究顯示，我國總體腦卒中終生發病風險為39.3%，位居全球首位，隨著腦卒中危險因素的流行，我國腦卒中疾病負擔有暴發式增長的態勢，推測2030年我國腦血管病事件發生率將較2010年升高約50%［2］。其中，缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，占所有腦卒中事件的80%以上，缺血性腦卒中的發生和進展受遺傳和環境因素相互影響，對高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥、吸煙、酗酒等高危因素的適當管理和控制，只能在一定程度上降低其發生率［3］。目前，研究遺傳變異與缺血性腦卒中易感性之間的關系，做到提前診斷、積極預防成為近年來關注的重點。目前，有研究顯示，亞洲人群缺血性腦卒中發生風險相關基因有5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）4G/5G、F5 41721G＞A，其中F5 41721G＞A亞洲人群突變率低，且此樣本中均無突變，在此不過多研究。同型半胱氨酸（Hcy）是一種含硫氨基酸，通過再甲基化和轉硫基途徑代謝以避免在體內聚集，Hcy水平升高已被證實是缺血性腦卒中的危險因素之一［4］，研究表明，MTHFR基因C677T多態性是導致血漿Hcy升高的主要遺傳因素。MTHFR是催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為5-甲基四氫葉酸的關鍵酶，5-甲基四氫葉酸是Hcy轉化為甲硫氨酸所需的甲基供體。MTHFR C677T基因中常見的C突變T可使酶活性降低35%，5-甲基四氫葉酸水平降低10%［5］，最終導致血漿Hcy水平升高。一項meta分析表明，MTHFR TT患者發生血管疾病的風險顯著更高，TT與CC純合子的卒中優勢比（OR）為1.26（1.14～1.40）［1］。PAI-1是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，是參與調節纖溶系統活性的平衡的重要組成部分，而纖溶系統活性的平衡是防止血栓形成的重要保護機制［6］。PAI-1的功能包括抑制組織型纖溶酶原激活物（tPA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）的活性，阻礙纖溶酶原轉化為纖溶酶。此外，PAI-1除了調節tPA和uPA活性外，還在代謝和血管疾病、腦損傷的進化和中風后的恢復中發揮著多種作用。目前研究發現，具有4G等位基因的個體在純合子條件下PAI-1水平升高。但PAI-1 4G/5G基因多態性與缺血性心腦血管疾病在不同地區、人群及種族的研究結果不一致，一直存在爭議［7-8］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集濟南市中心醫院2016年6月至2020年1月入院并進行基因多態性檢測的患者，最終篩選出進行缺血性腦卒中發生風險相關基因檢測的468例患者納入本研究。其中292例患者住院時有缺血性腦卒中病史，定義為卒中組，176例無腦卒中患者定義為對照組。所有研究對象為山東地區漢族人群，患者間無血緣關系，包括各年齡層和性別。缺血性腦卒中的診斷標準為急性局灶性或全局性神經功能缺損，持續時間＞24 h，無明顯原因（血管源性原因除外），從癥狀出現72 h內經腦部計算機斷層掃描（CT）或磁共振成像（MRI）掃描連續證實。

1.2 方法

1.2.1 數據收集 記錄入組患者信息，吸煙史、飲酒史、高血壓病史、糖尿病史、冠心病史，并測定空腹血清三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

1.2.2 基因位點測定 用EDTA（乙二胺四乙酸）抗凝管采集2～3 ml靜脈血，采用熒光染色原位雜交檢測法。取150μl臨床全血加入1 ml NH4Cl預處理液（北京華夏時代基因科技發展有限公司），靜置5 min后，待液體顏色變為澄清紅色，室溫3 500 r/min離心5 min，離心半徑8.5 cm，棄上清液，再加入核酸純化試劑（北京華夏時代基因科技發展有限公司），混勻后加入相應的測序反應通用試劑（北京華夏時代基因科技發展有限公司），采用雙通道實時熒光定量PCR儀（TL988A，西安天隆科技有限公司）完成MTHFR C677T與PAI-1 4G/5G的基因檢測。

1.3 統計學分析 采用SPSS 25.0對數據進行統計學分析。計量資料（年齡、TC、TG、HDL-C、LDL-C）呈非高斯分布，以M（P25，P75）表示，采用Wilcoxon秩次檢驗比較卒中組與對照組的臨床特征差異。采用卡方檢驗分析基因型分布和等位基因頻率。通過多因素logistic回歸分析，在加性模型、隱性模型和顯性模型中，校正年齡、性別后，研究MTHFR C677T和PAI-1 4G/5G多態性與缺血性腦卒中風險之間的關系。以MTHFR C677T為例，定義加性模型，CC、CT和TT分別編碼為2、1和0，顯性模型中CC編碼為1，CT、TT編碼為0，隱性模型中TT編碼為0，CT、CC編碼為1。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基線水平 共有468例患者參與此項研究，包括292例缺血性腦卒中患者（男181例，女111例），176例無缺血性腦卒中病史的患者（男87例，女89例），結果顯示，與對照組相比，性別（男性）、糖尿病史、吸煙史、飲酒史等變量均有增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05），詳見表1。

表1 兩組進行基因多態性檢測患者的基線信息

2.2 MTHFR C677T與PAI-1 4G/5G多態性分布MTHFRC677T和PAI-1 4G/5G等位基因頻率在卒中組和對照組中的分布符合Hardy-Weinberg平衡。MTHFR C677T（CC、CT、TT）在卒中組與對照組參與者的基因分布（P＝0.010）以及等位基因頻率（C和T）差異有統計學意義（P＝0.002），卒中組患者的TT基因型（49.32%）與T等位基因（67.98%）的頻率顯著高于對照組，PAI-14G/5G（4G/4G、4G/5G、5G/5G）的遺傳分布在卒中組和對照組間差異有統計學意義（P＝0.044），但等位基因頻率差異無統計學意義（P＝0.123）。詳見表2。

表2 兩組進行基因多態性檢測患者MTHFRC677T與PAI-1 4G/5G的基因型分布和等位基因頻率

2.3 MTHFR C677T與PAI-1 4G/5G多態性與缺血性腦卒中風險的相關性（1）MTHFR C677T基因型中，卒中組的患者中TT與對照組比較，增加了缺血性腦卒中的發生風險，校正年齡和性別后，TT基因型患者的缺血性腦卒中發 生 風 險 是CC的2.208倍（95%CI：1.149～4.243，P＝0.017）。同時采用顯性（CC比TT+CT）和隱性（TT比CT+CC）模型評估MTHFRC677T對缺血性腦卒中風險的影響，其中隱性模型與缺血性腦卒中發生風險呈正相關（OR＝2.375，95%CI：1.149～4.243，P＝0.017），綜上數據說明，T等位基因增加了缺血性腦卒中的發生風險。（2）PAI-1 4G/5G基因型中，卒中組的患者中4G/5G基因型與對照組比較，增加了缺血性腦卒中的發生風險，校正年齡和性別后，4G/5G基因型患者的缺血性腦卒中發生風險是5G/5G的1.907倍（95%CI：1.090～3.338，P＝0.024）。同時，校正年齡性別后，隱性模型（4G/5G+4G/4G比5G/5G）在卒中組與對照組間差異有統計學意義（OR＝1.857，95%CI：1.094～3.152，P＝0.022）。與4G/4G相比，5G/5G基因型顯著降低了缺血性腦卒中的發生風險（OR＝0.424，95%CI：0.209～0.860，P＝0.017），表明5G等位基因對缺血性腦卒中具有保護作用。詳見表3。

表3 468例進行基因多態性檢測患者3種遺傳模型與缺血性腦卒中發生風險的關聯性

2.4 MTHFR C677T與PAI-1 4G/5G的基因多態性聯合與缺血性腦卒中發生風險的相關性 數據顯示，MTHFR TT與PAI-1 4G/4G或4G/5G基因型聯合作用，發生缺血性腦卒中的風險高于對照組，其發生風險分別是MTHFR CC與PAI-1 5G/5G基因型組合的4.946倍（95%CI：1.546～15.819，P＝0.007）和3.193倍（95%CI：1.100～9.268，P＝0.033）。詳見表4。

表4 進行基因多態性檢測患者MTHFRC677T與PAI-1 4G/5G聯合與缺血性腦卒中發生風險的關聯性

3 討 論

缺血性腦卒中的發生和進展與腦血管危險因素密切相關，尋找其相關致病基因，做到提前診斷、積極預防成為近年來研究的重點。本研究收集山東地區患者MTHFR C677T與PAI-1 4G/5G基因多態性數據及缺血性腦卒中高危致病因素，首次闡明了MTHFRC677T與PAI-1 4G/5G基因組合與山東地區人群缺血性腦卒中發生風險相關性，根據對兩者基因多態性的統計分析得出，MTHFR C677T中T等位基因和PAI-1 4G/5G的4G等位基因的存在可能增加缺血性腦卒中的發生風險。研究表明，MTHFR TT與PAI-1 4G/4G組缺血性腦卒中的發生風險最高，此外，當聯合PAI-1 4G/5G時，缺血性腦卒中的發生風險也較高。結果表明，山東地區人群中，MTHFRC677T的T等位基因與PAI-1 4G/5G的4G等位基因的可能與缺血性腦卒中易感性相關。

研究得出，MTHFRC677T的加性和隱性模型在卒中組與對照組中存在顯著性差異，與CC基因型比較，TT基因型顯著增加了山東地區人群缺血性腦卒中的發生風險，這與相關文獻報道一致［9］。據文獻研究表明，MTHFRTT型變異個體需要更高的血清葉酸水平（≥15 ng/L或34 nmol/L），以克服TT變異引起的MTHFR酶缺陷［10］，對于MTHFR TT型患者可給予適當劑量的葉酸，可提高降低tHcy的能力，同時避免過量補充葉酸導致天花板效應和潛在不良反應。本研究對個體葉酸水平和遺傳背景下精準葉酸治療有一定的參考意義。

PAI-1 4G/5G基因4G等位基因能夠通過上調PAI-1基因表達從而引起血漿PAI-1水平升高，抑制纖溶酶的產生而促進血栓形成，與缺血性腦卒中發生風險相關。近年來對PAI-1 4G/5G多態性與缺血性腦卒中之間的關系進行了大量研究，但尚未達成一致結論，Tsantes等［11］收集了7 974例不同種族的數據分析得出PAI-1 4G/5G多態性與缺血性腦卒中沒有關聯。Bentley等［12］對3 336例和4 200例對照組分析顯示，與白種人的4G等位基因相比，PAI-1 4G/5G的5G等位基因與缺血性腦卒中風險相關。Cao等［13］分析了中國人群中4G/4G可使缺血性腦卒中發病風險增加63.9%（與4G/5G+5G/5G基因型比較）。此次研究結果表明，4G/4G與4G/5G均可以增加山東地區人群的缺血性腦卒中發生風險。對于不同研究成果可能的原因有遺傳或環境特異性，也可能與特定的卒中分型其潛在的生物機制不同有關，特定的突變或多態性可能選擇性的增加特定卒中分型的發生風險。

本研究探討了山東地區MTHFR C677T和PAI-1 4G/5G基因多態性分布與缺血性腦卒中發病的相關性并得出個體化風險預測結果，為臨床提供更為準確、實用的檢測數據。但是此次研究僅收集山東地區人群的數據，為單中心、回顧性研究，樣本量小，能否適用于其他地區民族仍需進一步研究，此外，PAI-1 4G/5G的5G等位基因作為缺血性腦卒中保護因素的確切作用機制還有待進一步研究。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。