HPLC法測定野菜馬蘭中青蒿素含量

石雪萍，余 芳，胡紫瓊

(江蘇經貿職業技術學院 健康學院，江蘇 南京 211168)

青蒿素(Artemisinin)是從復合花序植物黃花蒿葉中提取得到的一種無色針狀晶體。青蒿素是繼乙氨嘧啶、氯喹、伯氨喹之后最有效的抗瘧特效藥，世界衛生組織稱之為“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”。青蒿素主要用于治療瘧疾，除此以外，許多文獻還報道其具有抗炎、抗膿毒癥、抗腫瘤、放療增敏、抗菌增敏、抗組織纖維化以及治療其他寄生蟲病等作用。青蒿素的測定有碘量法、薄層掃描等方法。

馬蘭，菊科馬蘭屬植物，又稱馬蘭頭、雞兒腸、馬菜、田邊菊等。馬蘭屬于野生生長的植物，在田野、路邊、山坡上都有分布。現如今人工栽培的馬蘭在市場上普遍可見，其營養成分與野生馬蘭會有些許差別。但不管是野生的還是種植的馬蘭，經常食用都會有一定的保健作用。

馬蘭與青蒿同屬菊科植物，預實驗表明馬蘭含有青蒿素的成分。本研究采用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，簡稱HPLC)測定馬蘭中青蒿素的含量，并檢驗該方法的準確度。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料

青蒿素對照品(南京森貝咖生物科技有限公司，純度≥98%)，甲醇(色譜純)，0.2%NaOH，乙醇，石油醚(30～60 ℃)，蒸餾水。

1.1.2 儀器設備

電子不銹鋼水浴鍋：鄭州市亞榮儀器有限公司；電子天平：上海精密科學儀器有限公司；安捷倫1200高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；SZF-06A粗脂肪測定儀(索氏抽提器)：上海洪紀儀器有限公司。

其他：定性濾紙(15 cm×8 cm),脫脂棉,容量瓶(50、100、250 mL),移液管(1、2、5、10 mL),洗耳球,洗瓶,燒杯,100 mL量筒,離心管。

1.2 實驗方法

1.2.1 索氏提取法提取馬蘭中的青蒿素

取一張大小適宜的長方形定性濾紙，將其卷成直徑約2 cm的圓筒，將濾紙筒的一端折到筒中，制成圓筒的底部，取少許脫脂棉放入筒內，用脫脂棉細線扎起來。

將馬蘭試樣用粉碎機粉碎(不用太碎)，稱取2.0 g于濾紙筒內，在馬蘭試樣上放上一層脫脂棉，并將濾紙筒的頂端紙邊折入筒內，使整個濾紙筒高約4 cm。

搭好索氏提取器，水管是下進上出。將濾紙筒裝入索氏提取器，連接用無水乙醇洗滌過并烘干的平底燒，安裝冷凝器，裝好后在其上口放一漏斗，將100 mL石油醚經過漏斗轉移到抽提器中。在(50±1) ℃的水浴鍋中恒溫加熱，經過8次回流虹吸，提取時間為2 h，停止加熱。取下冷凝器，將平底燒瓶內的提取液轉移至100 mL容量瓶并用石油醚定容，再轉移至100 mL試劑瓶中，貼上標簽。

1.2.2 HPLC法測定馬蘭中青蒿素的含量

1.2.2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(75∶25)；檢測波長：260 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：35 ℃。

1.2.2.2 系統適用性試驗

取馬蘭供試品溶液，以轉速13000 r·min-1離心3 min，按上述1.2.2.1色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。理論板數以青蒿素峰計算不應高于4500，色譜峰對稱因子均在0.95～1.05，青蒿素峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。

1.2.2.3 標準曲線的繪制

將0.1 mg·mL-1的青蒿素對照品溶液通過0.45 μL的膜過濾至進樣瓶，放入儀器，分別以5、10、15、20 μL 的進樣量進樣。根據所測得的色譜峰，記錄色譜峰的出峰時間和峰面積。青蒿素對照品色譜圖見圖1。

圖1 青蒿素對照品色譜

以青蒿素進樣量(y)對峰面積值(x)進行線性回歸，得回歸方程為y=9.1756x+14.964。結果表明，青蒿素的進樣量在0～20 μL，與峰面積呈良好線性關系。青蒿素液相標準曲線見圖2。

圖2 青蒿素液相標準曲線

1.2.2.4 精密度試驗

取濃度為0.1 mg·mL-1的青蒿素對照品溶液，用0.45 μL的膜過濾至進樣瓶，連續進樣6次，每次進樣量為20 μL，分別記錄色譜峰的出峰時間和峰面積，根據數據計算一日內精密度；以同樣步驟連續進樣5 d，記錄出峰時間和峰面積，根據數據計算日間精密度。結果顯示，日內精密度的RSD=0.95%，日間精密度的RSD=0.96%，表明該儀器的精密度良好。

1.2.2.5 穩定性試驗

分別吸取濃度為0.1、0.2、0.3 mg·mL-1的青蒿素對照品溶液，用0.45 μL的膜過濾至進樣瓶，于0、3、6、9、12 h分別進樣，記錄出峰時間和峰面積。結果顯示，RSD分別為0.63%、0.50%和0.55%，表明對照品溶液在12 h內穩定性良好。

1.2.2.6 加樣回收率試驗

將青蒿素標準溶液和馬蘭供試品溶液分別以1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5的比例混合，并用0.45 μL的膜過濾，分別加入五個進樣瓶，進樣量都為20 μL。以上述進樣條件進行測定，記錄相應的出峰時間和峰面積。根據數據計算青蒿素的回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率

2 青蒿素含量測定

取馬蘭供試品溶液通過0.45 μL的膜過濾至進樣瓶，并放入HPLC儀器內，進樣量為40 μL，以上述進樣條件進行測定，記錄出峰時間和峰面積，測定樣品馬蘭中青蒿素的含量。計算3次測定結果的平均值，馬蘭中青蒿素的含量為0.285 mg/g。馬蘭樣品色譜圖見圖3，青蒿素含量測定結果見表2。

圖3 馬蘭樣品色譜

表2 HPLC法測定青蒿素含量

3 結論

HPLC法是經分離后測定的一種方法，將青蒿素類似物分離，排除了干擾，可以更有效地對青蒿素進行測定。這種方法的精密度、穩定性、加樣回收率的試驗結果均較好，適用于馬蘭中青蒿素含量的測定。