長鏈非編碼RNA FER1L4在腎癌組織中的表達及其對腎癌細胞增殖侵襲和遷移的影響

雷坤陽 謝文杰 孫庭

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是指一類長度＞200 nt 的轉錄本。雖然LncRNA不具備翻譯功能，但其參與基因表達的轉錄調控以及細胞中的信號傳遞。研究表明，人為沉默或過表達LncRNA 將對腫瘤進展產生影響，有關LncRNA 研究是目前的熱點之一[1]，并已多有在腎癌中作用的報道[2-3]。LncRNA FER1L4 是一個近年來新發現的LncRNA，在胃癌中最早被研究[4]。LncRNA FER1L4 在多種腫瘤中異常表達，如肝細胞癌及卵巢癌等，并在這些腫瘤的發生和進展中均起到至關重要的作用[5]，但在腎癌中尚鮮有報道。本研究旨在對LncRNA FER1L4 在腎癌中的作用及其分子生物學機制進行初步探討。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 GEPIA 數據庫 通過GEPIA 數據庫分析523例患者的腎癌組織及其中100 例患者的配對癌旁組織中的LncRNA FER1L4 表達水平，分析516 例腎癌患者的組織標本（258 例高表達、258 例低表達）與生存期的關系。

1.1.2 臨床標本 收集2020年1月至2021年1月65例于南昌大學第一附屬醫院行腎癌根治術患者的腎癌組織及癌旁組織標本，所有標本均經病理診斷為腎細胞癌，組織標本采集后立即放入液氮，并放至-80℃冰箱內保存。患者術前均未行放射治療、化療或靶向治療。根據LncRNA FER1L4 表達水平的平均值，將65 例腎癌組織分為高表達組（n=32）和低表達組（n=33）。本研究獲得本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.3 主要試劑 RNA 抽提試劑盒購自上海康為生物公司；逆轉錄及定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）擴增試劑盒購自武漢賽維爾生物公司；轉染試劑Lipofectamine 3 000 購自美國Invitrogen 公司；siRNA 購自廣州銳博生物公司；所有抗體均購自美國Cell Signaling 公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR 采用Trizol 試劑盒提取組織及細胞中的RNA，紫外分光光度計檢測所提取RNA 的濃度，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，并用PCR 儀進行擴增。LncRNA FER1L4 引物的上游序列為5′-GGGG ACGGAAGATGACC-3′，下游序列為5′-TTGTGAAC CCGCTGAAGA-3′；內參GAPDH 引物的上游序列為5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，下游序列為5′-A TGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′。

1.2.2 細胞培養及轉染 人正常腎小管上皮細胞（HK-2）以及5 種人腎癌細胞系（786-O、A498、ACHN、OSRC2、769-P）分別購自中科院細胞庫及武漢普諾賽生命科技有限公司。將細胞放置在溫度為37℃，CO2濃度為5%的培養箱中，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基進行培養，每3 天更換1 次培養基。待細胞生長至30%～50%密度時，使用Lipofectamine 3 000將LncRNA FER1L4 的siRNA（Si）組、陰性對照（NC）組以及空白對照（BC）組分別轉染至細胞。

1.2.3 CCK8 實驗 將細胞消化、離心并重懸，調整細胞密度為1×104/mL，加入0.2 mL 細胞懸液到96 孔板中，培養24、48 及72 h 后，分別加入CCK-8 試劑10 μL/孔，在37℃條件下培養2～4 h，在450 nm 處檢測各組細胞的吸光度。

1.2.4 平板克隆實驗 將細胞消化、離心并重懸，調整細胞密度為1×103/mL，加入0.3 mL 細胞懸液到6孔板中，每隔3 天更換1 次培養基。待2 周后或可肉眼觀察到明顯集落形成時，PBS 清洗細胞，甲醛固定，并用0.1%結晶紫染色。拍照并計算集落形成率。

1.2.5 劃痕實驗 將細胞均勻接種至6 孔板中，待細胞密度達到80%時，使用200 μL 槍頭在每孔中進行“十”字劃痕，PBS 清洗后用無血清培養基培養，在0 和第24 h 在顯微鏡下拍照，并計算細胞遷移的距離。

1.2.6 Transwell 實驗 在Transwell 小室的上室中加入基質膠，待其凝固后備用。在下室中加入600 μL含20%胎牛血清的培養基，放入Transwell 小室。將細胞常規消化、離心后，用無血清培養基重懸，調整細胞密度為1×105/mL，在上室中加入細胞懸液0.2 mL。培養24 h 后用甲醛固定，0.1%結晶紫染色。用棉簽將上室擦洗干凈，風干后在顯微鏡下拍照并計數。

1.2.7 Western blot 檢測 采用Western blot 檢測腎癌細胞中上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）通路相關蛋白表達的變化。使用RIPA裂解液將細胞裂解并提取蛋白質，BCA 法檢測蛋白濃度。使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將聚偏二氟乙烯膜與一抗孵育過夜后再與二抗孵育1 h，最后用顯影液進行成像并分析各條帶的灰度值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析。連續性變量采用x±s表示，組間比較采用t檢驗或χ2檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 腎癌組織和細胞中LncRNA FER1L4 表達與臨床病理學特征的關系

對GEPIA 數據庫相關的數據分析顯示，與癌旁組織相比，腎癌組織中的LncRNA FER1L4 高表達（圖1A），并且高表達患者的生存期更短（P＜0.05，圖1B）。RT-qPCR 檢測顯示，65 例患者腎癌組織中的LncRNA FER1L4 表達為8.63±1.79，明顯高于癌旁組織的1.84±0.95，兩者比較差異具有統計學意義（P＜0.001，圖2A）；腎癌細胞系786-O 中的LncRNA FER1L4 表達為5.45±0.72、A498 為3.52±0.54、ACHN為2.75±0.45、OSRC2為4.98±0.86、769-P為3.31±0.71，均明顯高于正常腎小管上皮細胞的1.00±0.15，差異均具有統計學意義（均P＜0.05，圖2B）。由于LncRNA FER1L4 在786-O 和OSRC2 細胞系中的表達最高，因此選擇這2 種細胞系用于后續實驗。本研究分析發現，腎癌組織中的LncRNA FER1L4 高表達與腫瘤體積、腫瘤分期、淋巴結轉移及遠處轉移呈顯著相關，而與其他臨床病理特征無關（均P＜0.05，表1）。

圖1 腎癌組織中的LncRNA FER1L4 表達與患者生存期的關系

圖2 腎癌中LncRNA FER1L4 的表達

表1 65 例腎癌患者組織中的LncRNA FER1L4 表達與臨床病理學特征的關系

2.2 LncRNA FER1L4 對體外腎癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響

CCK-8 及平板克隆實驗結果顯示，與NC 組及BC 組相比，Si 組細胞的增殖能力明顯減弱，差異具有統計學意義（均P＜0.05，圖3，圖4A）；Transwell 實驗結果顯示，Si 組細胞的侵襲能力明顯低于NC 組及BC 組，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖4B）；劃痕實驗結果顯示，Si 組細胞的遷移能力與NC 組及BC 組相比明顯降低（P＜0.05，圖4C）。

圖3 LncRNA FER1L4 對腎癌細胞增殖能力的影響

圖4 LncRNA FER1L4 對腎癌細胞的影響

2.3 LncRNA FER1L4 通過EMT 信號通路對腎癌的影響

Western blot 檢測顯示，Si 組細胞的Vimentin 和N-cadherin 的表達下調，而E-cadherin 表達上調（均P＜0.05，圖5），LncRNA FER1L4 可能通過激活腎癌細胞中的EMT 從而促進腎癌的進展。

圖5 沉默LncRNA FER1L4 的各組細胞中的EMT 通路相關蛋白變化

3 討論

腎癌是人類常見的惡性腫瘤之一，且死亡率一直呈上升趨勢[6]。在腎細胞癌分型中，以透明細胞癌占多數，且對放射治療和化療均不敏感[7]，通過腎根治性切除術，復發率仍高達20%～40%，術后5年生存率僅為20%[8]。因此，靶向藥物治療作為一種新興的治療方法越來越受到重視，尋找新的靶點則成為目前分子生物學領域最急迫的任務[9]。

LncRNA FER1L4 在惡性腫瘤中的作用已多有研究報道，如LncRNA FER1L4 在高級別膠質瘤中的表達明顯高于低級別膠質瘤，并且與患者的不良預后相關，沉默LncRNA FER1L4 的表達，膠質瘤細胞的生長明顯被抑制[10]；LncRNA FER1L4 在體外可促進口腔鱗癌細胞的增殖、侵襲和遷移，沉默LncRNA FER1L4 的表達可抑制癌細胞在體內成瘤的作用[11]。LncRNA FER1L4 還可作為抑癌因子在腫瘤中發揮作用，如過表達LncRNA FER1L4 可促進骨肉瘤細胞的凋亡，從而抑制腫瘤的進展[12]。本研究為了探究LncRNA FER1L4 在腎癌中的作用，對GEPIA 數據庫進行檢索，并分析了腎癌中LncRNA FER1L4 的表達及其與患者生存期之間的關系，結果顯示腎癌組織中LncRNA FER1L4 高表達，并且其表達量與患者生存率呈負相關。為了研究LncRNA FER1L4 在腎癌組織及細胞中的表達量，本研究采用RT-qPCR 檢測腎癌患者組織及各個腎癌細胞系中LncRNA FER1L4表達，發現腎癌組織及細胞中的LncRNA FER1L4 表達明顯高于癌旁組織及正常腎小管上皮細胞。為驗證LncRNA FER1L4 在腎癌中的作用，本研究體外實驗結果顯示，沉默LncRNA FER1L4 可抑制腎癌細胞的增殖、侵襲和遷移。

EMT 與癌細胞的轉移能力密切相關。EMT 通路涉及包括Vimentin 和E-cadherin 等多種蛋白。由于大多數腫瘤的進展過程中往往伴隨著EMT 發生，EMT 在惡性腫瘤細胞的侵襲和遷移過程中起著至關重要的作用，已有研究證實了LncRNA FER1L4 與EMT 的關系[13]。本研究采用Western blot 檢測顯示，沉默LncRNA FER1L4 表達，腎癌細胞中的Vimentin 和N-cadherin 表達下調，而E-cadherin 表達上調。由此，可以推斷LncRNA FER1L4 促進腎癌細胞侵襲和遷移的作用可能部分與EMT 有關。但LncRNA FER1L4 對腎癌細胞增殖作用的影響無法用EMT 機制解釋，研究顯示腫瘤細胞的增殖受PI3K/AKT 信號通路以及JAK/STAT 信號通路的調控[14-15]，但有待進一步研究與驗證。

綜上所述，腎癌組織和細胞中的LncRNA FER1L4表達上調，與患者的腫瘤直徑、腫瘤分期、淋巴結轉移及遠處轉移相關。LncRNA FER1L4 可通過影響EMT 而促進腎癌的進展，并為腎癌的靶向治療提供了新的思路，但其具體機制尚需進一步研究。