SIRT5通過調控G6PD促進結腸癌細胞的糖代謝及增殖*

劉迪 張秀梅

結腸癌是常見的易發于結直腸部位的消化道惡性腫瘤。近年來，中國結腸癌的發病率和病死率均呈上升趨勢[1]，嚴重威脅著人們的生命健康。異常的代謝模式是惡性腫瘤的一個重要特征，有氧糖酵解已被確認為腫瘤細胞的主要代謝特征[2]，其為腫瘤細胞的生長提供原料和能量。SIRT5 是Sirtuin 家族的一員，主要定位于線粒體基質中，具有不同的去乙酰化酶活性、去琥珀酰化、去戊二酰基化和去丙二酰基化的催化活性，可誘導糖酵解和葡萄糖有氧氧化增加[3]。戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，PPP）是糖酵解支路，因此該途徑流量和速度的改變直接影響糖酵解。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）存在于胞質中，是PPP 的限速酶，其代謝產物NADPH 和5-磷酸核糖是維持腫瘤細胞生長增殖所必需的物質。目前尚鮮見關于SIRT5 對結腸癌細胞糖代謝、生長增殖的報道及其中可能的分子機制。本研究旨在檢測SIRT5 與G6-PD 在結腸癌臨床樣本中的表達水平，探討SIRT5 對結腸癌細胞糖代謝、增殖的影響以及該機制是否通過調控G6PD 實現，從而為臨床治療結腸癌提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

HCT116 和HT29 人結腸癌細胞系由錦州醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室提供。結腸癌組織切片（包括癌組織和癌旁組織）由中國醫科大學附屬第一醫院病理科提供。SIRT5 干擾RNA 購自上海吉瑪公司，SIRT5 質粒購自武漢淼靈生物科技有限公司；葡萄糖氧化酶試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；乳酸測試盒購自南京建成生物公司；PCR 引物購自北京鼎國昌盛生物公司；兔抗人SIRT5、G6PD 多克隆抗體購自美國ABclonal 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、分組及轉染 HCT116 和HT29 細胞置于37℃、5%CO2培養箱中進行培養。將細胞接種于6 孔板中，待細胞密度達到70%～90%且狀態良好時進行轉染，SIRT5 干擾實驗分為si-SIRT5-1、si-SIRT5-2、si-SIRT5-3 和陰性對照（si-NC）組，其序列分別為si-SIRT5-1：5′-CCAGCUACGAACAGAUUC ATTUGAAUCUGUUCGUAGCUGGTT-3′，si-SIRT5-2：5′-GUCCAGCUUUAUCAGGAAATTUUUCCUG AUAAAGCUGGACTT-3′，si-SIRT5-3：5′-GGAGAUC CAUGGUAGCUUATTUAAGCUACCAUGGAUCU CCTT-3′，si-NC：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUT TACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；SIRT5 過 表達實驗分為HA 空載質粒轉染（Control）組、HASIRT5 質粒轉染組。回復實驗分si-SIRT5 單獨轉染組、si-SIRT5+G6PD 質粒共轉組、si-NC+Flag 空載質粒共轉組。轉染6 h 后更換為含10%胎牛血清和雙抗的RPMI 1640 完全培養液。

1.2.2 Western blot 法檢測SIRT5、G6PD 蛋白的表達水平 待HCT116、HT29 細胞均生長至可消化傳代時，各取適量細胞懸液收集細胞測SIRT5 蛋白，SIRT5 過表達組轉染48 h、干擾組轉染36 h 后收集細胞測G6PD 蛋白。在收集的細胞中加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑提取總蛋白。采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，制備樣品。將蛋白經過SDS-PAGE 電泳分離，90 V、90 min 轉膜轉至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉2 h 后，將膜與SIRT5、G6PD 和Actin 抗體結合4℃孵育過夜。次日PVDF 膜經TBST 洗滌后用二抗室溫孵育2 h，TBST 洗滌后ECL 法發光成像。

1.2.3 培養液中葡萄糖、乳酸濃度的測定 SIRT5 過表達組轉染42 h、SIRT5 干擾組轉染30 h 后收集并更換一次完全培養液。換液后6 h 再分別收集培養液，按照葡萄糖氧化酶試劑盒和乳酸測試盒說明書檢測培養液中葡萄糖與乳酸的濃度。

1.2.4 CCK-8 實驗檢測細胞活力 SIRT5 過表達組及干擾組細胞均轉染24 h 后用胰酶消化，每組按4×103個/孔細胞密度接種于96 孔板，并設3 個復孔。分別于接種細胞后0、1、2、3 天內的恒定時間點在每孔加入10 μL CCK-8 溶液，5% CO2、37℃細胞培養箱中孵育2 h，用酶標儀檢測各孔在450 nm 處的吸光值。

1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞的增殖能力 胰酶消化轉染24 h 后，對上述分組細胞進行收集，各組分別取400 個/孔細胞接種到6 孔板中，于培養箱培養10～14 天，直到大多數單個細胞集落含有50 個細胞以上時停止培養。4% 多聚甲醛固定細胞后加入0.1%結晶紫溶液染色，細胞克隆計數并計算克隆形成率（克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%）。

1.2.6 RT-PCR 檢測轉染后G6PD 的mRNA 表達水平 SIRT5 過表達組轉染48 h、SIRT5 干擾組轉染36 h 后用Trizol 法提取細胞總RNA，按ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit 說明書配制反應體系進行One Step RT-PCR 反應。PCR 擴增反應條件為50℃30 min，95℃ 3 min，（95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s）×30 個循環，72℃ 5 min。擴增后的反應樣品即進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為80 V，完成后置凝膠于凝膠成像系統中顯影。G6PD 序列：F5’-CTCAGCCCCCGG AAACGG-3’，R5’-GATGAAGGTGTTTTCGGGCAG-3’。

1.2.7 免疫組織化學法檢測SIRT5、G6PD 在結腸癌組織中的表達情況 所有結腸癌組織切片（包括癌組織和癌旁組織）于60℃烘箱烤片2 h，將切片常規脫蠟、水化、抗原修復，分別滴加一抗和二抗，DAB 顯色，再常規脫水透明、樹脂封片晾干、鏡下采集圖像。每張切片各選5 個視野，根據染色程度和染色陽性率評分之積進行評分，總分0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為陽性（++），9～12 分為強陽性（+++）[4]。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0 軟件和GraphPad 8.0 進行統計學分析。計量資料（數據均重復3 次以上）以±s表示，組間差異比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計 學意義。

2 結果

2.1 SIRT5 在HCT116、HT29 細胞中的表達

Western blot 結果顯示，SIRT5 蛋白在HT29 細胞中的表達水平較低，在HCT116 細胞中的表達水平較高（圖1A）。在后續實驗，本研究將對HCT116 細胞進行SIRT5 干擾處理、對HT29 細胞進行SIRT5過表達處理，以檢測SIRT5 對結腸癌細胞糖代謝、增殖的影響。與此同時，本研究通過Western blot 在HCT116 細胞中驗證了SIRT5 不同干擾序列的干擾效果。結果表明，干擾效果最顯著的是si-SIRT5-3 轉染組（圖1B），故接下來所有細胞實驗干擾組的處理均用篩選出的si-SIRT5-3 進行。

圖1 SIRT5 在結腸癌細胞中的表達

2.2 SIRT5 促進結腸癌細胞葡萄糖的消耗和乳酸的生成

對培養液中葡萄糖濃度的檢測結果顯示，HCT116 細胞沉默SIRT5 后培養液中葡萄糖的含量明顯增加（P=0.005，圖2A），HT29 細胞過表達SIRT5 后培養液中葡萄糖的含量明顯減少（P=0.004，圖2B），上述結果顯示SIRT5 促進葡萄糖的消耗。而對培養液中乳酸的濃度進行檢測后發現，HCT116 細胞沉默SIRT5 后培養液中乳酸的含量則顯著降低（P=0.005，圖2C），HT29 細胞過表達SIRT5 后培養液中乳酸的濃度顯著增加（P=0.004）（圖2D），上述結果提示SIRT5 促進乳酸的生成。

圖2 調控SIRT5 對結腸癌細胞糖代謝的影響

2.3 SIRT5 促進結腸癌細胞的增殖

CCK-8 實驗顯示，HCT116 細胞si-SIRT5 組的OD 值與si-NC 組及Untreated（空白）組相比均明顯降低（P=0.002，P=0.003）（圖3A）；HT29 細胞SIRT5 質粒組的OD 值與Control 組及Untreated 組相比均明顯增高（P=0.024，P=0.040）（圖3B），說明SIRT5 可增強結腸癌細胞的活性。HCT116 細胞干擾SIRT5 后，si-SIRT5 組的細胞克隆數及克隆形成率明顯少/低于si-NC 組及Untreated 組（P＜0.001）（圖3C，3D）；HT-29 細胞過表達SIRT5 后，SIRT5 質粒組的細胞克隆數及克隆形成率明顯多/高于Control 組及Untreated組（P＜0.001）（圖3E，3F），這表明SIRT5 提高了結腸癌細胞的克隆形成能力。

圖3 調控SIRT5 對結腸癌細胞增殖的影響

2.4 SIRT5 正向調控結腸癌細胞內G6PD 的表達

以上研究結果證實，SIRT5 可促進結腸癌細胞葡萄糖的消耗、乳酸的生成，并可提高結腸癌細胞的活力和增殖能力。本實驗組對其調控機制，以及是否通過調控戊糖磷酸途徑的限速酶G6PD 來實現上述功能進行進一步研究。

RT-PCR 結果顯示，HCT116 細胞沉默SIRT5 后G6PD mRNA 的表達水平明顯降低（圖4A）；HT29 細胞過表達SIRT5 后，G6PD mRNA 的表達水平明顯升高（圖4B）。同樣，HCT116 細胞沉默SIRT5 后的Western blot 結果顯示G6PD 蛋白的表達水平顯著降低（圖4C）；HT29 細胞過表達SIRT5 后，G6PD 蛋白的表達水平顯著升高（圖4D）。

圖4 SIRT5 調控G6PD 表達的情況

2.5 G6PD 參與SIRT5 介導的結腸癌細胞的糖代謝及增殖過程

本研究在HCT116 細胞中進行了干擾回復實驗以驗證G6PD 是否參與SIRT5 介導的結腸癌細胞的糖代謝及增殖過程：在該細胞中單獨轉染si-SIRT5、共轉染si-SIRT5 和G6PD 質粒、共轉染si-NC 和Flag 空載質粒。結果顯示si-SIRT5+G6PD 質粒共轉組與si-SIRT5 組相比，培養液中葡萄糖濃度降低（P=0.012）、乳酸濃度升高（P=0.041）、細胞活性增強（P=0.003）、細胞克隆數增多及克隆形成率增高（P＜0.001），而si-SIRT5+G6PD 質粒共轉組與si-NC+Control 共轉組相比，以上各項實驗結果均無顯著性差異（P＞0.05）（圖5）。這說明G6PD 在SIRT5 調控的結腸癌細胞的糖代謝、增殖過程中發揮了一定作用。

圖5 HCT116 細胞的干擾回復實驗

2.6 SIRT5、G6PD 在結腸癌組織及癌旁組織的表達情況

為進一步驗證SIRT5 和G6PD 在結腸癌臨床樣本中表達的相關性，本研究應用免疫組織化學法對結腸癌臨床樣本進行了檢測，結果表明SIRT5 和G6PD在癌旁組織中表達較低，而在癌組織中的表達明顯增高（圖6）。

圖6 SIRT5、G6PD 在結腸癌組織中的表達（IHC×200）

3 討論

有研究表明，腫瘤細胞為滿足其快速增殖的需要，需消耗大量的葡萄糖，即使在氧氣充足的條件下，也主要依靠糖酵解供能，這種代謝特征被稱為Warburg效應或有氧糖酵解[5]。糖酵解是供應腫瘤細胞能量和生產代謝終產物的關鍵[6]，腫瘤細胞以此維持其生存，抑制糖酵解具有抑制腫瘤細胞增殖和殺傷腫瘤細胞的作用，這有望成為治療腫瘤的靶點。

現有證據表明，SIRT5 多作為癌基因發揮作用，在促進腫瘤發生發展的同時對患者的預后不利[7-9]，它可以通過調控3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、乳酸脫氫酶B（LDHB）等在糖酵解過程中發揮作用[10-11]。為驗證SIRT5 在結腸癌中作為何種角色及如何影響結腸癌細胞的糖代謝和增殖能力，本研究首先從細胞水平探究了SIRT5 在結腸癌細胞系HCT116、HT29中的表達情況，隨后對SIRT5 表達水平較高的HCT116 細胞進行了SIRT5 干擾處理，發現細胞對葡萄糖的消耗和乳酸的生成能力也就是糖代謝能力降低（P＜0.05）、細胞的活力和克隆形成能力也明顯降低（P＜0.05），即細胞的增殖能力減弱。同時對SIRT5 表達水平較低的HT29 細胞進行了SIRT5 過表達處理，發現細胞的糖代謝能力增強（P＜0.05）、細胞的增殖能力提高（P＜0.05）。以上結果證明SIRT5 可促進結腸癌細胞的糖代謝和增殖。

腫瘤細胞在糖酵解過程中某些酶的活性會增高，如G6PD，已有研究證實G6PD 在多種癌癥中高表達[12-13]，密切影響腫瘤細胞的發生發展，并與患者化療預后不良相關。SIRT5 與G6PD 在結腸癌中是否相關以及SIRT5 對結腸癌細胞糖代謝、增殖的機制與G6PD 有無關系。針對以上問題，本研究從蛋白和mRNA 水平分別驗證了兩者之間的相關性。結果顯示，在下調SIRT5 的表達后HCT116 細胞內G6PD蛋白和mRNA 的表達水平明顯降低；在過表達SIRT5后HT29 細胞內G6PD 蛋白和mRNA 的表達水平明顯提高。由此可見，SIRT5 對G6PD 有明顯的正向調控作用。為證實SIRT5 對結腸癌細胞的糖代謝、增殖的調控作用是通過G6PD 發揮的，本研究在HCT116細胞中共轉了si-SIRT5 和G6PD 質粒。結果顯示，與si-SIRT5 單獨轉染組相比，si-SIRT5+G6PD 質粒共轉組細胞的糖代謝、增殖能力都得以恢復（P＜0.001）。由此推斷G6PD 參與SIRT5 調控結腸癌細胞葡萄糖的消耗、乳酸的生成和增殖。SIRT5、G6PD 的免疫組織化學結果顯示其在結腸癌組織中均為高表達，這也與部分研究結果一致[14-15]。

綜上所述，SIRT5 對G6PD 的表達呈正調控，且SIRT5 通過調控G6PD 促進結腸癌細胞的糖代謝、增殖，具體機制還需進一步研究。

致謝：感謝中國醫科大學附屬第一醫院病理科提供實驗組織切片。