微波輔助提取刺梨多糖工藝優(yōu)化及抗腫瘤活性研究

唐健波 呂 都 潘 牧 彭 梅 楊 娟

(1. 貴州省農(nóng)科院食品加工研究所，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014；3. 貴州醫(yī)科大學藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014)

多糖是大量單糖通過糖苷鍵連接而成的生物大分子聚合物，普遍存在于動植物的器官或組織中[1]。近年來，多糖因其獨特的化學結構、高生物活性和功能特性而受到消費者的廣泛關注。許多從果蔬中提取的天然多糖被作為功能性成分添加于各種食品或藥物中[2-4]。除了具有改善工業(yè)產(chǎn)品保水和保油、起泡和乳化性能等功能特性外[5]，還具有抗氧化[6-7]、抗炎[8]、抗腫瘤[9]、抗?jié)僛10]、抗病毒[11]和免疫活性[12]等生物功能。

刺梨(RosaroxbunghiiTratt, RRT)，屬薔薇科薔薇屬落葉灌木植物，主要分布于中國西南省份海拔1 000～1 600 m的山區(qū)[13]。截至2020年底，貴州省刺梨種植面積突破13.3萬hm2，全省刺梨鮮果產(chǎn)量超10萬t，同比增長51%，其中35家刺梨重點加工企業(yè)年鮮果加工能力近14萬t。研究表明，刺梨果實中富含多種營養(yǎng)元素和功能成分，包括多糖[14]、多酚[15]、維生素C[16]、超氧化物歧化酶[16]、黃酮[17]、維生素B以及多種礦物質(zhì)元素[18]等，具有多種保健或藥用功效，在功能性食品及藥品的開發(fā)上具有廣闊的應用前景。

刺梨多糖(RosaroxbunghiiTratt polysaccharide，RRTP)是刺梨果實中的主要功能性成分，合適的提取方法不僅是提高多糖提取率的關鍵，也是維持多糖的理化、流變性、功能、結構和生物學特性的關鍵[19]。傳統(tǒng)的多糖提取方法需在熱回流裝置中進行長時間高溫狀態(tài)下的提取，不僅提取效率低，而且還會對多糖的生物活性造成破壞[20]。隨著工藝技術的進步，超聲波輔助提取、微波輔助提取、加壓水提取和酶輔助提取等新技術新方法在有效提高多糖提取效率和生物活性方面取得了很大進展。其中，微波輔助提取技術可以在較短的時間內(nèi)提取多糖，降低溶劑和能源消耗，且對多糖活性破壞較小。研究擬采用響應面法對微波輔助提取刺梨多糖工藝進行優(yōu)化，并以超聲輔助提取刺梨多糖為對照，評價兩種不同工藝條件下提取刺梨多糖的抗腫瘤活性，以期為刺梨多糖在食品中的應用提供理論依據(jù)，為刺梨產(chǎn)業(yè)的縱深發(fā)展提供助力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

刺梨干果：市售；

昆明種小鼠：雌雄各半，體重(20±2) g，貴州醫(yī)科大學試驗動物中心；

S180瘤株：由貴州大學楊再昌教授惠贈并由貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室妥善傳代并保存；

無水乙醇、濃硫酸：分析純，重慶川東化工有限公司；

葡萄糖：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；

環(huán)磷酰胺：分析純，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；

苯酚、冰醋酸、亞甲藍、羧甲基纖維素鈉、生理鹽水：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

微波化學反應器：MCR-3型，上海丞明儀器設備有限公司；

連續(xù)波長酶標儀：MD spectra MAX-190型，美國MD公司；

電子分析天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

真空干燥箱：DZF-6021型，上海精宏實驗設備有限公司；

高速萬能粉碎機：FW100型，天津泰斯特儀器有限公司；

生物顯微鏡：PH100型，鳳凰光學集團有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 刺梨干果預處理 將刺梨干果于60 ℃干燥至恒重，于高速萬能粉碎機粉碎1 min，過40目篩，用80%乙醇加熱回流提取8次去雜，每次2 h，用布氏漏斗抽濾，60 ℃真空干燥至恒重，制得預處理樣品。

1.2.2 刺梨多糖微波輔助提取工藝 取預處理樣品10 g，置于兩口圓底燒瓶中，按照一定液料比加入蒸餾水，置于微波化學反應器反應釜中，在設定微波功率和反應時間條件下進行提取，提取3次并合并濾液，減壓濃縮至一定體積，添加無水乙醇使樣品中乙醇體積分數(shù)為80%，攪拌均勻，4 ℃冰箱靜置12 h，抽濾并用無水乙醇洗滌析出的絮凝物2～3次，絮凝物于60 ℃真空干燥至恒重，得刺梨粗多糖，將粗多糖粉碎后過160目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 刺梨多糖含量測定 采用苯酚—硫酸法[21]。以蒸餾水為空白對照，以葡萄糖為標準品，吸光度為橫坐標，葡萄糖質(zhì)量為縱坐標，于490 nm處用連續(xù)波長酶標儀測定吸光值，繪制標準曲線(Y=0.006 1X+0.06，R2=0.995 9)，并按式(1)計算刺梨多糖得率。

(1)

式中：

Y——刺梨多糖得率，%；

m1——刺梨粗多糖質(zhì)量，g；

ω——粗多糖中多糖含量，%；

m2——預處理樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 刺梨多糖微波輔助提取單因素試驗

(1) 微波功率：取樣品10 g，固定液料比30∶1 (mL/g)，微波時間10 min，微波次數(shù)3次，考察微波功率(80，160，240，320，400 W)對刺梨多糖得率的影響。

(2) 液料比：取樣品10 g，固定微波時間10 min，微波功率240 W，微波次數(shù)3次，考察液料比[10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 (mL/g)]對刺梨多糖得率的影響。

(3) 微波時間：取樣品10 g，固定液料比40∶1 (mL/g)，微波功率240 W，微波次數(shù)3次，考察微波時間(6，10，14，18，22，26 min)對刺梨多糖得率的影響。

(4) 微波次數(shù)：取樣品10 g，固定液料比40∶1 (mL/g)，微波功率240 W，微波時間22 min，考察微波次數(shù)(1，2，3，4，5次)對刺梨多糖得率的影響。

1.2.5 響應面優(yōu)化 在單因素試驗的基礎上，固定微波次數(shù)3次，以微波功率、液料比和微波時間3個因素為自變量，按照Box-Benhnken中心組合試驗(BBD)原理，以刺梨多糖得率為響應值，利用Design-Expert.V8.0.6軟件進行響應面試驗設計及結果分析。

1.2.6 S180實體瘤模型的建立 參照Zong等[22]的方法并適當修改。將保存于液氮罐中的S180瘤株進行復蘇，用醫(yī)用酒精對小鼠腹部進行消毒，取0.2 mL復蘇的腫瘤液接種于小鼠腹腔中，于標準動物試驗室[溫度(23±2) ℃，濕度(55±5)%，白天黑夜各12 h]中進行自由飲水和進食。接種7 d后，用無菌注射器從小鼠腹腔抽取腫瘤液，并進行第二次傳代，經(jīng)臺盼藍染色計數(shù)，活細胞數(shù)>95%方可進行后續(xù)腫瘤接種。采用無菌注射器抽取第二次傳代小鼠腹腔中的腫瘤液，用生理鹽水稀釋3倍制成細胞懸液，將細胞懸液按每只小鼠0.2 mL的劑量皮下接種于小鼠右腋下。試驗過程中，如果出現(xiàn)空白組小鼠腫瘤平均瘤重<1 g、20%小鼠瘤重<0.49 g或小鼠死亡數(shù)>20%中的任一情況，則判定試驗失敗。

1.2.7 動物分組及試驗 參照Cai等[23]的方法并修改。挑選健康昆明種小鼠96只，雌雄各半，按1.2.6的方法進行腋下腫瘤接種，建立S180實體瘤模型。小鼠接種24 h后，將小鼠隨機分為8組(n=12)：空白對照組(CT)，環(huán)磷酰胺組(CTX)，微波提取多糖高、中、低劑量組(H-MPS、M-MPS、L-MPS)、超聲提取多糖高、中、低劑量組(H-UPS、M-UPS、L-UPS)，每組小鼠12只，雌雄各半。用生理鹽水配制3.5 mg/mL的環(huán)磷酰胺溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)作為CTX組藥劑，用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配制不同劑量的多糖藥劑，以0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液作為空白組藥劑。其中：CT組每天灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉0.1 mL/10 g；CTX組腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液0.1 mL/kg，第一次注射后，間隔3 d注射一次，共注射3次；刺梨多糖高、中、低劑量組的灌胃劑量分別為400，200，100 mg/(kg·d)。試驗持續(xù)10 d。

1.2.8 抑瘤率的計算 參照賈福懷等[24]的方法并修改。小鼠最后一次灌胃后，禁食12 h，以脊椎脫臼法處死，剝離出小鼠右腋下腫瘤，稱重，按式(2)計算抑瘤率。

(2)

式中：

R——抑瘤率，%；

m1——給藥組平均腫瘤質(zhì)量，g；

m2——空白組平均腫瘤質(zhì)量，g。

1.2.9 外周血白細胞計數(shù) 參照姚佳等[25]的方法并修改。小鼠最后一次灌胃后，禁食12 h，用毛細管(0.9 mm×100 mm)進行眼眶取血，并進行外周血白細胞計數(shù)。具體方法為：向試管中加入白細胞稀釋液(冰醋酸2 mL、蒸餾水98 mL、10 g/mL的亞甲藍溶液3～5滴)0.38 mL，再加入小鼠眼眶新鮮血液20 μL，輕微震蕩2 min混勻后立即吸取10 μL懸液充入血球計數(shù)板計數(shù)池內(nèi)，靜置2～3 min后于顯微鏡低倍鏡下對四角的4個大方格內(nèi)白細胞總數(shù)進行計數(shù)，并按式(3)計算白細胞總數(shù)。

(3)

式中：

W——白細胞數(shù)，L-1；

c——大方格內(nèi)白細胞總數(shù)。

1.2.10 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測定 參照姚佳等[25]的方法并修改。小鼠最后一次灌胃后，禁食12 h，稱重后以脊椎脫臼法處死，分別去除小鼠的胸腺和脾臟，擦干周邊血跡后進行稱重，并按式(4)和式(5)分別計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

(4)

(5)

式中：

T——胸腺指數(shù)；

S——脾臟指數(shù)；

m1——胸腺質(zhì)量，mg；

m2——脾臟質(zhì)量，mg；

M——小鼠質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(Duncan模式)和多重比較(P<0.05為顯著差異)，結果以平均值±標準偏差表示；采用OriginPro 2018軟件對試驗數(shù)據(jù)進行繪圖，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；所有工藝優(yōu)化試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 微波功率對刺梨多糖得率的影響 由圖1可知，隨著微波功率的增加，刺梨多糖得率先上升后下降，當微波功率為240 W時，刺梨多糖得率最大。刺梨多糖得率下降可能是由于隨著微波功率的增加，微波產(chǎn)生的熱效應也相應地增加，微波加熱使樣品吸收微波能而產(chǎn)生熱效應，樣品細胞表面或細胞壁產(chǎn)生裂紋或細孔，從而促使刺梨多糖加速溶出[26]。而隨著微波功率的進一步增大，一方面樣品細胞的表面效應增加阻礙了介質(zhì)滲入和刺梨多糖的溶出，另一方面微波的過熱效用也會導致刺梨多糖分解，這都可能導致刺梨多糖得率下降[27]。因此，選擇微波功率為160，240，360 W 3個水平進行響應面試驗。

圖1 微波功率對刺梨多糖提取率的影響Figure 1 The effects of microwave power on theextraction yield of RRTP

2.1.2 液料比對刺梨多糖得率的影響 由圖2可知，隨著液料比的增加，刺梨多糖得率先上升后下降，當液料比為40∶1 (mL/g)時多糖得率最大，與張彥慧等[28]的變化趨勢基本一致。隨著液料比的增加，樣品細胞內(nèi)外的多糖濃度差增大，促進了多糖向水中擴散，從而提高了刺梨多糖的得率，當液料比過大時，單位體積的水溶液吸收的微波能降低，產(chǎn)率也隨之降低[29]。此外，提取工藝中液料比越大，多糖后期的處理工作量相對也會增加，提取成本升高。因此，選擇液料比為30∶1，40∶1，50∶1 (mL/g)3個水平進行響應面試驗。

圖2 液料比對刺梨多糖得率的影響Figure 2 The effects of liquid to solid on theextraction yield of RRTP

2.1.3 微波時間對刺梨多糖得率的影響 由圖3可知，隨著微波時間的延長，多糖得率先顯著性增加后趨于平穩(wěn)，與楊嘉丹等[30]的結論基本一致。隨著微波時間的延長，微波的穿透、反射及吸收效果提升，多糖的提取效果也相應提高[30]。當微波時間>18 min時，刺梨多糖提取基本完成，得率基本不再升高，此外長時間的微波加熱可能會使多糖分解。因此，選擇微波時間為18，22，26 min 3個水平進行響應面試驗。

圖3 微波時間對刺梨多糖得率的影響Figure 3 The effects of microwave time on theextraction yield of RRTP

2.1.4 微波次數(shù)對刺梨多糖得率的影響 由圖4可知，隨著微波次數(shù)的增加，刺梨多糖得率先顯著性提高(P<0.05)后趨于平穩(wěn)。因此，固定微波次數(shù)為3次進行刺梨多糖提取優(yōu)化試驗。

圖4 微波次數(shù)對刺梨多糖得率的影響Figure 4 The effects of microwave times on theextraction yield of RRTP

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 預測模型及方差分析 在單因素試驗的基礎上，

固定微波次數(shù)為3次，以微波功率、液料比和微波時間3個因素為自變量，以刺梨多糖得率為響應值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(BBD)原理進行三因素三水平響應面試驗設計。試驗因素及水平表見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素及水平表

表2 響應面試驗設計及結果

經(jīng)軟件回歸擬合，3個提取變量與刺梨多糖得率的關系的二次多項式方程為：

Y=3.22+0.10A-0.037B+0.17C+7.50E-003AB-0.077AC-0.052BC-0.14A2-0.12B2-0.17C2。

(6)

由表3可知，模型具有較大的F值，同時具有非常低的P值(P<0.000 1)，說明該預測模型差異極顯著，能夠較好地預測刺梨多糖得率。失擬項P=0.930 1>0.05，差異不顯著，說明模型與所選試驗因素之間具有很好的擬合度。同時，模型決定系數(shù)R2=0.992，變異系數(shù)CV=0.9%，表明此模型能夠預測99.2%的刺梨多糖得率的變化，說明試驗結果較可靠。模型方差分析結果顯示，一次項A、B、C，交互項AC、BC及二次項A2、B2、C2對刺梨多糖得率影響顯著(P<0.01)，表明各影響因素之間存在明顯的協(xié)同作用。由F值可知，影響微波輔助提取刺梨多糖得率的因素大小順序為微波時間>微波功率>液料比。

表3 響應面模型方差分析?

2.2.2 響應面及影響因素交互作用分析 由圖5可知，AC和BC的響應面圖相對于AB的更為陡峭，表明圖形對應的兩組影響因子交互作用更為明顯，其對刺梨多糖得率的影響更顯著[31]。AB的等高線圖呈圓形，說明微波功率和液料比兩者之間的相互作用不明顯；AC和BC的等高線為斜橢圓形，說明微波功率和微波時間、液料比和微波時間之間存在顯著的相互作用，與方差分析結果基本一致。

圖5 各因素及其交互作用對刺梨多糖得率的影響Figure 5 Effects of different variables and interaction on the extraction rate of RRTP

2.2.3 回歸模型優(yōu)化 通過Design-Expert V 8.0.6軟件分析對回歸方程進行優(yōu)化擬合可知，微波輔助提取刺梨多糖的最佳條件為：微波功率256.78 W，液料比37.41∶1.00 (mL/g)，微波時間24.02 min，提取次數(shù)3次，此時刺梨多糖理論得率為3.28%。為驗證預測結果的可信度，將提取工藝參數(shù)調(diào)整為：微波功率240 W，液料比37∶1 (mL/g)，微波時間24 min，提取次數(shù)3次，該工藝條件下的刺梨多糖得率為(3.19±0.05)% (n=3)，與預測值的契合度為97.26%，主要原因是受限于設備，但契合度基本達到預期，可以證實該回歸模型能較好地用于預測刺梨多糖的提取。與超聲提取的刺梨多糖[21]進行對比，微波輔助提取方法具有提取時間短、提取效率高等優(yōu)點，提取得率相較于超聲提取提高了46.33%，具有較好的應用價值。

2.3 刺梨多糖抗腫瘤試驗結果

由表4可知，兩種方法提取的刺梨多糖均具有一定的抗腫瘤效果，但在最佳灌胃劑量和腫瘤抑制效果上均存在一定的差異。其中，微波提取刺梨多糖在100 mg/kg劑量時，對腫瘤小鼠的抑瘤率最好，達到(52.52±0.96)%，明顯高于超聲提取刺梨多糖的。與CTX組相比，兩種方法中不同刺梨多糖試驗組的白細胞、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯升高，均表現(xiàn)出更優(yōu)的腫瘤小鼠免疫能力提升作用。與CT組相比，CTX組的白細胞數(shù)量明顯減少，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)也明顯下降，但抑瘤率達到(62.32±1.09)%，為所有試驗組中最高。從灌胃劑量產(chǎn)生的抑制腫瘤的效果來看，兩種方法提取的刺梨多糖均在低劑量時產(chǎn)生最優(yōu)的抑瘤效果，且L-MPS組和L-UPS組的白細胞、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)相對于同組其他劑量來說更接近CT組，可能是低劑量的刺梨多糖在提升腫瘤小鼠免疫能力的同時還可能具有減輕腫瘤小鼠發(fā)炎癥狀的作用。

表4 刺梨多糖對荷S180小鼠抑瘤作用、外周血白細胞及其臟器的影響?Table 4 Effects of PPRT on tumor inhibition, peripheral blood leucocyte and viscera index on S180 tumor-bearing mice

3 結論

以刺梨干果為原料，采用響應面法優(yōu)化了微波輔助提取刺梨多糖工藝。結果表明，微波輔助提取刺梨多糖的最優(yōu)工藝條件為微波功率240 W，液料比37∶1 (mL/g)，微波時間24 min，提取次數(shù)3次，此時刺梨多糖得率為(3.19±0.05)% (n=3)。抗腫瘤活性研究表明，在灌胃劑量為100 mg/kg時，微波和超聲輔助提取的刺梨多糖對S180腫瘤小鼠均具有最大的抑瘤率。其中，微波輔助提取刺梨多糖的抑瘤率為(52.52±0.96)%，抗腫瘤活性更優(yōu)，并顯著提高了腫瘤小鼠的白細胞數(shù)量、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。說明在此工藝條件下提取的刺梨多糖，具有一定的提升腫瘤小鼠免疫能力和抗腫瘤作用，可作為潛在的功能性食品添加劑來源。后續(xù)應開展多種提取方法協(xié)同提取工藝及其活性評價研究，以及刺梨多糖的提純分析和特性研究。