魚刺傷肉芽腫九例臨床分析

馮亞輝 李仁哲 嚴紅霞 史冬梅，4

1 濟寧醫學院，山東濟寧，272001；2 濟寧市第一人民醫院檢驗科，山東濟寧，272001；3 濟寧市第一人民醫院皮膚科，山東濟寧，272001；4 濟寧市第一人民醫院醫學真菌實驗室，山東濟寧，272001

海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)屬于非典型分枝桿菌又稱為非結核分枝桿菌(Nontuberculousmycobacteria，NTM)，在自然界中主要分布于水中，依據其生長速度劃分為緩慢生長組，光照產色，最適生長溫度為30～32℃，機會性人體感染中多表現為淺部感染，深部感染少見，但亦可引發諸如關節炎、骨髓炎等深部感染，加重多與原發皮損診斷不明使用類固醇激素有關。其臨床表現可有局限斑塊，沿淋巴管走行的皮下結節等，常與孢子絲菌病、皮膚腫瘤等難以鑒別[1]。外傷后接觸史、臨床表現、病理活檢、組織培養、PCR檢測等均有助于診斷。本文對既往經病原學診斷成功治療的9例魚刺傷或外傷后感染海分枝桿菌的病例進行分析報道，以期提高臨床對本病的認識。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集濟寧市第一人民醫院皮膚科自2020年8月至2021年4月經病原學診斷為海分枝桿菌的病例共9例，其中男7例、女2例。記錄患者年齡、職業、感染途徑、病程時間、皮損形態、病理檢查結果、病原學培養結果、結核菌素實驗(PPD)及結核菌感染T細胞斑點試驗(T-spot)結果、胸部影像學結果、治療方案和轉歸情況等。

1.2 方法

1.2.1 病理活檢及組織培養 將患者皮損拍照后完成病理活檢，充分消毒取材區域，切取皮損處組織至淺筋膜層，將所得組織縱行剖開。一半置于福爾馬林溶液固定并完成HE、PAS及抗酸染色；一半在無菌容器中充分剪碎，分別接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基、哥倫比亞血平板、巧克力平板、MiddleBrook 7H10瓊脂中，沙氏葡萄糖瓊脂及哥倫比亞血平板置于27℃培養，巧克力平板及MiddleBrook 7H10瓊脂置于30℃培養，每3天觀測一次，直至第5周。

1.2.2 病原菌分離及鑒定 持續觀察直至培養基上出現淺黃色或深黃色，表面略粗糙，邊緣不規則菌落。挑取單菌落于MiddleBrook 7H10瓊脂純化培養7天。將純化菌株行飛行時間質譜(MALDI-TOF)及16S核糖體RNA基因測序鑒定，MALDI-TOF大于99.9%置信區間結果及NCBI數據庫比對相似度大于99%結果為最終鑒定結果，將測序結果與NCBI查詢到海分枝桿菌參比菌株基因導入MAGA X軟件，建立最大似然比法的系統發育樹，對所得菌株進行系統發育分析。

1.2.3 統計學方法 將患者臨床資料進行匯總，并繪制三線表進行描述性統計。

2 結果

2.1 臨床資料 本研究共納入9例經病原學診斷為海分枝桿菌感染患者，其中男7例(78%)，女2例(22%)。年齡分布區間為21～63歲，平均(40.4±14.16)歲。9例患者中廚師或后廚工作人員4例，魚類養殖或銷售2例，工人3例。所有患者均有外傷史，其中明確魚類創傷6例(67%)，創傷后污水沾染3例(33%)。病程0.5～12個月，平均(4.6±4.41)個月。其中3例患者表現為局限斑塊型(圖1a～1c)，6例患者表現為沿淋巴管線狀分布的暗紅色皮下結節(圖1d～1j)；皮損8例發生于上肢、1例發生于下肢。9例患者均行PPD實驗，7例陽性，2例陰性。5例患者同期行T-spot實驗，3例陽性，2例陰性，其中PPD實驗及T-spot實驗雙重陽性2例，PPD實驗陰性T-spot實驗陽性1例；9例患者胸部CT均未見明顯異常。患者經過單獨克拉霉素(clarithromycin, CLR)、克拉霉素聯合異煙肼(isoniazid, INH)或利福平(rifampicin, RFP)和/或聯合光動力治療(ALA-PDT)，均痊愈或明顯好轉。將患者原發皮損消退70%定義為好轉，統計單用藥物治療及藥物聯合光動力治療的平均好轉周期，單用藥物組平均好轉周期為(5.8333±1.33)周，光動力聯合藥物治療平均好轉周期為(2.67±0，578)周，治療時間明顯縮短，見表1。

表1 魚刺傷肉芽腫患者一覽表

圖1 1a～1c:局限斑塊型海分枝桿菌感染；1d～1j:沿淋巴管分布的皮膚結節型海分枝桿菌感染(1a、1b、1d～1j均為上肢皮損,1c為下肢皮損)

2.2 組織病理 全部患者均進行病理學檢查，均完善HE、PAS及抗酸染色，其中HE染色均表現為表皮鱗狀上皮樣增生，真皮及皮下灶性壞死(圖2a)、微膿腫形成(圖2b)，伴淋巴細胞、上皮樣細胞及少許多核巨細胞構成肉芽腫性炎，可見有纖維素性壞死的非干酪樣肉芽腫，無典型結核樣肉芽腫改變(圖2c～2f)，PAS及抗酸染色均為陰性。

圖2 2a:表皮鱗狀上皮樣增生，真皮及皮下灶性壞死(HE，×100)；2b;微膿腫形成(HE，×100)；2c、2d:可見有纖維素性壞死的非干酪樣肉芽腫，無典型結核樣肉芽腫改變(HE，×100)；2e、2f:淋巴細胞、中性粒細胞、上皮樣細胞及少許多核巨細胞構成亞急性肉芽腫性炎(HE，2e:×200;2f:×400)

2.3 菌種鑒定及發育 全部患者組織培養標本均分離到海分枝桿菌，真菌及常規細菌培養均為陰性。原代菌株分離時間7～28天，平均(17.2±5.14)天。菌落均為深黃色、光滑或稍粗糙，熒光染色陽性，抗酸染色陽性(圖3a～3d)。將菌落純化至MiddleBrook 7H10瓊脂培養7天，MALDI-TOF鑒定均為海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)，置信區間大于99.9%。16S基因測序后經NCBI數據庫比對，全部菌株與海分枝桿菌相似度均大于99%。MAGA X建立最大似然比發育樹。9株菌均被鑒定為海分枝桿菌。

圖3 3a:組織培養3周，巧克力平板可見深黃色邊緣粗糙的菌落；3b:MiddleBrook 7H10瓊脂培養10天，可見深黃色光滑菌落；3c:熒光染色可見桿狀菌體，藍色熒光；3d:抗酸染色可見紫紅色桿菌；3e:基于16S基因，采用最大似然比模型行發育分析，選取M.arabiense為外群，臨床菌株與海分枝桿菌在100%支持率下聚集在一起

3 討論

海分枝桿菌對魚類等水生動植物及人類均可造成感染，部分研究將其認定為人畜共患病，但不存在人際傳播的風險。海分枝桿菌感染對某些專業人員可能是一種職業危害，但許多感染發生在在家中養魚愛好者身上，因此又名“養魚者手指綜合征”[2]。國人對魚類需求量較大，但魚類食品加工的廚師罹患風險并沒有被正確認知，正如我們研究中約半數感染者為廚師或后廚人員，這也應當被視為職業損害的一種。大部分的感染途徑為魚鰭或魚刺扎傷、接觸或更換水族箱水體均可能造成感染，有趣的是，近年來其他非海水來源的水體中也出現海分枝桿菌的分離記錄如煤礦污水等[3]。這也與我們所報道的病例相一致，其中1例患者為煤礦工人，井下工作創傷后接觸煤礦污水繼發海分枝桿菌感染。因此對海分枝桿菌的分布有待進一步研究。

相關研究指出約60%的海分枝桿菌的皮膚感染表現為原發創傷處孤立的結節、潰瘍、疣狀增生；25%的表現為類孢子絲菌病的沿淋巴管線狀分布的紅色至紫紅色炎性結節或膿丘疹，伴或不伴破潰[1]。無論局限型或淋巴管型皮損均需同孢子絲菌病及皮膚腫瘤相鑒別。因此，詳細的創傷史、接觸史、病理組織學檢查、組織培養對診斷都是不可或缺的[4]。海分枝桿菌最適生長溫度為30～32℃，37℃下并不生長，因此海分枝桿菌的感染多局限在皮膚，但也不乏深部感染的病例，多因局部類固醇激素注射有關[5]。全身播散感染罕見，僅在造血干細胞移植及抗腫瘤壞死因子治療患者中有報道，但因缺乏特異性癥狀，診斷也較為困難[6-8]。

海分枝桿菌感染常規的輔助檢查應包括PPD及T-spot實驗。但海分枝桿菌與結核桿菌在發育學上具有相近的親緣關系，因此常出現交叉免疫反應，故PPD實驗通常為陽性[2]，T-spot實驗也可表現為陽性[9，10]，這也與我們回顧的病例相一致；盡管無法與結核感染相鑒別，但區分其他種類感染十分重要，因此兩者均有進行的必要[11]。

在海分枝桿菌皮膚感染早期，組織病理檢查表現為非特異性的炎性浸潤。感染進一步發展，多表現為多核巨細胞肉芽腫，并可出現纖維素樣壞死，但無干酪樣壞死[12，13]。病理組織中抗酸染色陽性率較低[14]，但仍需抗酸及PAS染色，目的在于明確是否桿菌感染，與真菌感染相鑒別，為臨床上精準的診斷提供證據。

分離得到海分枝桿菌對診斷具有決定性意義。必須提高病原菌分離意識，進行組織病理檢查的同時，應進行組織分離培養。通常情況下，正確的培養取材陽性率約為70%，培養條件選擇十分重要，海分枝桿菌最適生長溫度為30～32℃，平均生長周期較長，因此合適的溫度及較長的培養時間十分必要，應不少于4周。目前MALDI-TOF與16S基因測序為常見的菌株鑒定手段。MALDI-TOF中由于分枝桿菌之間較近的親緣關系，許多亞種之間難以鑒別，諸如海分枝桿菌與潰瘍分枝桿菌，但推薦該方法可作為原代菌株的快速鑒定[15]。16S基因在分枝桿菌進化中高度保守，因此其可以很好的用于不同菌種之間的鑒別，此外hsp65、gyrA、rpoB基因均具備較高的鑒定效率[16]。

海分枝桿菌的治療遵循以藥物治療為主，局部物理治療為輔的策略。在大多數研究中，海分枝桿菌已經表現出對抗結核藥物異煙肼、乙胺丁醇和吡嗪酰胺的抗藥性。利福平和利福布丁較為敏感；米諾環素、多西環素、克拉霉素、利奈唑胺、司帕沙星、莫西沙星、亞胺培南、磺胺甲惡唑和阿米卡星具有中等活性，因此臨床用藥多應從上述藥物中選擇[17-20]。一般推薦口服兩種敏感抗生素至癥狀消除后1～2個月，總療程平均為3～4個月[21]。對于早期較輕的病變，可單獨使用一種抗生素，如克拉霉素、多西環素等。對于較為復雜的患者，則需要使用利福平和乙胺丁醇聯合大環內酯類或四環素進行治療[22]。本文中患者使用克拉霉素與異煙肼聯合，也顯示了良好的治療效果，是否此類患者主要因克拉霉素發揮了治療效果，未來可進一步臨床驗證。手術在皮膚感染中的使用有一定的爭議，尚未發現手術可使患者顯著獲益的證據[23]。光動力治療、電切術、X線治療、冷凍治療、局部高溫治療等治療也取得良好效果[24，25]。與此同時，當機體存在此類感染時，建議停用TNF-α抑制劑或其他免疫抑制劑，警惕感染深部擴散。

皮膚原發海分枝桿菌感染作為常見的NTM感染形式，其臨床表現多樣，極易誤診。因此仔細追溯職業接觸及創傷史極為重要，組織病理學、PPD實驗、T-spot實驗有助于縮小診斷范圍，合適條件下的組織培養聯合MALD-TOF及16S基因測序可準確鑒定菌株，提供診斷金標準。克拉霉素單獨或聯合利福平、乙胺丁醇的兩聯用藥方案具有較好的療效。光動力療法及局部物理治療也可作為輔助治療縮短療程。最后，高危人群的主動自我保護對減少感染的發生至關重要。