大鼠腰椎間盤退變模型的建立及其形態(tài)學觀察

陳 莎，王詩忠，鄧德萬

（1.福建省立金山醫(yī)院，福建 福州350028；2.福建醫(yī)科大學，福建 福州350108；3.福建中醫(yī)藥大學附屬福鼎醫(yī)院，福建 福鼎355200）

下腰痛（low-back pain，LBP）是一種以后背、腰骶部疼痛為主要表現(xiàn)，可伴有下肢放射痛或麻木的臨床疾病。在成年人群中患病率可達12%，嚴重影響患者工作及生活［1］。1970年CROCK［2］提出椎間盤紊亂學說，研究證實椎間盤退變可誘發(fā)下腰痛，但其機制尚未明確［3］。理想的動物體內(nèi)退變模型是研究椎間盤退變機制及有效治療手段的必要基礎(chǔ)，本文通過建立一種大鼠腰椎間盤退變模型，并進行形態(tài)學觀察，為相關(guān)研究提供動物模型依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF級3月齡健康雄性SD大鼠16只，體質(zhì)量250～300 g，由上海動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 實驗試劑 蘇木素伊紅染色液（上海碧云天生物科技公司）；TUNEL試劑盒（美國Promega公司）。

1.3 實驗儀器 切片機、倒置顯微鏡（德國LeiCa公司）；激光共聚焦顯微鏡（日本Leiss公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型制作 實驗大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量進行編號，運用隨機數(shù)字表法將16只大鼠分為假手術(shù)組及模型組，每組8只。大鼠腰椎間盤退變模型的制作采用纖維環(huán)穿刺法［4-5］，并加以改進，術(shù)前16只大鼠禁食禁水12 h，稱重，計算10%水合氯醛用量（3 mL／kg），予腹腔注射麻醉。模型組進行造模手術(shù)，假手術(shù)組僅切開皮膚再縫合。造模手術(shù)操作：大鼠剃毛暴露腹部手術(shù)區(qū)，清潔后仰臥固定，消毒后鋪巾，于前正中線右側(cè)旁開0.5 cm處做一縱行切口，暴露腹后壁，保護好腸管及下腔靜脈，從脊柱附著點上，緩慢剝離腰大肌，暴露L3／L4、L4／L5、L5／L6椎間盤（髂嵴平對L5／L6椎間盤或L6椎體），取21G穿刺針平行于軟骨終板進針，穿刺深度約為2.3 mm。穿刺成功后，依序關(guān)腹、縫皮。每只大鼠術(shù)后放入單籠飼養(yǎng)，予青霉素5萬單位肌注，每日1次，連續(xù)3 d。術(shù)后注意大鼠進食情況及步態(tài)，有無傷口感染及尿潴留等。

2.2 取材2組大鼠同等條件喂養(yǎng)8周后，以過量10%水合氯醛腹腔注射處死大鼠，經(jīng)后正中線切開皮膚、逐層分離，剝除椎旁肌肉韌帶，取下完整腰椎節(jié)段后，于冰面上快速取出L4／L5椎間盤組織，放入4%多聚甲醛中固定48 h，于37℃恒溫箱中以10%EDTA脫鈣30 d，包埋切片后予HE染色及TUNEL法進行形態(tài)學觀察。

2.3 HE染色法觀察椎間盤組織病理情況 將切片分別浸入蘇木精及伊紅中染色、水洗、烘干、封片后，于光鏡下觀察各切片組織形態(tài)學結(jié)構(gòu)，并進行組織學分級評分［6］，該評分級別共三級，每一級的評分內(nèi)容包含4項：纖維環(huán)結(jié)構(gòu)、纖維環(huán)與髓核分界線、髓核中的基質(zhì)及髓核中的細胞，滿足任意一項即計入1分；最低0分，最高12分。

2.4 TUNEL法檢測椎間盤組織凋亡情況 切片染色處理后，采用DeadEnd熒光測定TUNEL系統(tǒng)檢測細胞凋亡，于激光共聚焦顯微鏡（Leiss LSM710）下分析樣本，200倍高倍視野下觀察并拍照，鏡下細胞核由DAPI染為藍色，凋亡細胞呈綠色熒光。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 椎間盤組織HE染色 假手術(shù)組椎間盤組織中髓核無明顯皺縮，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整，與纖維環(huán)界限分明，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整、排列有序；模型組椎間盤組織中髓核皺縮、結(jié)構(gòu)紊亂，髓核細胞腫脹，髓核纖維環(huán)之間界限不清，纖維環(huán)局部撕裂、排列紊亂，纖維環(huán)細胞出現(xiàn)腫脹。見圖1。

圖1 2組椎間盤組織HE染色圖（×25）

3.2 2 組椎間盤組織學分級評分 假手術(shù)組椎間盤組織學分級評分為（5.00±0.82）分，模型組為（11.25±0.96）分，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3.3 TUNEL法檢測椎間盤組織凋亡情況 鏡下可見，細胞核為藍色熒光，TUNEL陽性細胞呈綠色熒光。假手術(shù)組僅見少量TUNEL陽性細胞表達，模型組TUNEL陽性細胞表達較假手術(shù)組明顯增多。見圖2。

圖2 2組椎間盤組織TUNEL染色圖（×200）

4 討 論

建立可靠的動物椎間盤退變模型，是研究椎間盤源性疼痛機制及其治療手段的基礎(chǔ)。目前已報道如鼠、兔、豬、羊、犬等動物均已建立椎間盤退變模型，造模手段主要有以下幾類：①改變脊柱生物力學，如利用加壓裝置［7］、剪除椎旁肌肉韌帶［8］等誘發(fā)退變；②造成椎間盤損傷，如纖維環(huán)切開、穿刺法［9］、髓 核抽 吸法［10］、髓核 內(nèi)注 射 木 瓜凝乳蛋 白酶法［11］；③阻斷軟骨終板血供通路，減少椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)以誘導(dǎo)退變［12-13］；④自發(fā)退變模型，如通過敲除特定基因，造成椎間盤物質(zhì)代謝異常以引起退變，或使用具有椎間盤自發(fā)退變特性的動物，如沙鼠［14］。以上幾類模型各有優(yōu)勢，但生物力學改變模型需要特殊加壓裝置或較高的操作技巧，髓核損傷模型不利于后續(xù)形態(tài)學觀察及成分研究；終板損傷模型具有理論基礎(chǔ)，但相關(guān)研究結(jié)果提示其可重復(fù)性差、缺乏穩(wěn)定性；自發(fā)退變模型最為接近自然退變過程，但造模周期長、成本高，故應(yīng)用受限。本模型采用的纖維環(huán)穿刺法，模擬纖維環(huán)損傷后，髓核組織突出、脫水、變性等椎間盤退變過程。穿刺深度選擇2.3 mm，可達纖維環(huán)全層，退變程度較纖維環(huán)部分穿刺法（穿刺深度1.5 mm）更高，且在穿刺4周后即可觀察到退變表現(xiàn)［4］。

椎間盤退變與遺傳基因、營養(yǎng)缺乏、生物力學改變、炎癥反應(yīng)及細胞凋亡等多種因素相關(guān)。其中細胞凋亡是機體為維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，細胞自主進行的有序死亡，細胞凋亡所致的活性細胞數(shù)目減少、基質(zhì)合成不足，可引發(fā)椎間盤正常結(jié)構(gòu)破壞。有研究發(fā)現(xiàn)，人體退變椎間盤組織標本中，細胞凋亡現(xiàn)象超過半數(shù)［15］。TUNEL法是一種結(jié)合分子生物學及形態(tài)學的實驗方法，廣泛應(yīng)用于凋亡細胞或凋亡小體的檢測中，能直觀準確地反映凋亡細胞的形態(tài)及位置。故本實驗采用該方法結(jié)合最常見的HE染色法，觀察驗證椎間盤退變模型，鏡下可見模型組椎間盤結(jié)構(gòu)紊亂、纖維環(huán)與髓核界限模糊、TUNEL陽性細胞表達較假手術(shù)組明顯增多等退變表現(xiàn)。

綜上所述，本實驗建立了一種有效的椎間盤退變模型，其操作簡便、重復(fù)性好、創(chuàng)傷較小，術(shù)后8周可觀察到明顯退變，較為經(jīng)濟，可作為椎間盤退變研究的模型基礎(chǔ)。