紫草素對特應性皮炎小鼠TSLP/OX40L通路及Th1/Th2平衡的影響

吳金環(huán)，鄭寶勇，張理濤

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種常見的炎癥性皮膚病，其主要特征為慢性濕疹皮疹和瘙癢，可能產生抑郁、睡眠障礙，甚至自殺意念，從而對患者生活質量造成嚴重影響［1］。隨著中醫(yī)藥應用的不斷完善和發(fā)展，中藥治療AD的不良反應發(fā)生率相對較低，療效較好［2］。傳統(tǒng)藥用植物紫草具有治療陰道炎、玫瑰糠疹、急性和慢性肝炎的功效。紫草素是提取自紫草根的萘醌類化合物，具有抗炎、抗癌、抗菌等作用，可用于治療扁平疣、銀屑病，局部應用于燒傷治療，促進傷口愈合［3-4］。胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）是過敏性炎癥及輔助性T細胞（Th）2極化的重要介導因子，其下游因子為OX40及其配體OX40L。研究發(fā)現，抑制受損皮膚中TSLP、白細胞介素（IL）-4和IL-6水平可改善AD［5］。另外，Th1/Th2的平衡對2，4-二硝基氟苯（2，4-Dinitrofluorobenzene，DNFB）誘導的AD也有改善作用［6］。但是，目前尚鮮見紫草素對AD小鼠TSLP/OX40L通路及Th1/Th2平衡影響的報道，本研究旨在對此進行觀察，為紫草素用于AD患者的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SPF級BALB/c小鼠90只，雄性，體質量15~20 g，6~8周齡，購自北京唯尚立德生物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0009。動物實驗符合國家實驗室動物倫理保護標準及相關法律規(guī)定，按照3R原則給予實驗動物人道的關懷照顧。實驗前給予3 d適應性飼養(yǎng)，溫度22℃，濕度55%，12 h/12 h明暗循環(huán)。

1.1.2 實驗藥物 紫草素（純度98%）購自成都普斯生物科技有限公司；潑尼松龍（5 mg/片，國藥準字H33021207）購自浙江仙琚制藥股份有限公司。

1.1.3 主要試劑和儀器 小鼠TSLP、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-4和干擾素（IFN）-γ酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司；HE染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；FIX&PREM破膜劑購自美國Caltag公司；DNFB、十二烷基硫酸鈉（SDS）和β-actin鼠抗均購自美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和BAC蛋白定量試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TSLP兔多克隆抗體（Anti-TSLP）、OX40L兔單克隆抗體（Anti-OX40L）和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗均購自英國Abcam公司；酶標儀Fax-20100購自美國INStat公司；尼康SMZ745光學顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司；流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；蛋白凝膠成像儀、轉膜儀和電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 AD小鼠模型的制備與分組 參考蔣麗等［7］采用的方法并加以改進，局部外涂DNFB制備AD小鼠模型，造模期約為25 d。待小鼠背部皮膚出現紅斑、水皰、部分糜爛、上覆黃色痂皮即為造模成功。將造模成功的小鼠使用隨機數字表法分為模型組，紫草素低（20 mg/kg）、中（30 mg/kg）、高（40 mg/kg）劑量組和陽性對照組（潑尼松龍，10 mg/kg［8］），每組15只。另取15只作為正常對照組。各給藥組大鼠按10 mL/kg灌胃相應藥物，模型組和正常對照組灌胃等體積溶劑（含0.5%羧甲基纖維素鈉的蒸餾水），1次/d，連續(xù)15 d。

1.2.2 觀察記錄小鼠搔抓行為及評價皮膚炎性損傷 分別于給藥后的第5、10和15天，將每只小鼠單獨放置，觀察并記錄在10 min內小鼠搔抓背部的次數，連續(xù)搔抓算作1次；參考臨床特應性皮炎積分（SCORAD）指數評價標準［9］，分別在給藥后第7、15天評價小鼠皮損嚴重程度。紅斑、鱗屑、水腫和表皮脫落分為無（0分）、輕（1分）、中（2分）、重（3分）4個等級。

1.2.3 HE染色觀察小鼠皮損組織病理學變化 末次給藥結束后，小鼠腹腔注射10%水合氯醛（400 mg/kg）深度麻醉，實施安樂死。收集小鼠眼眶血（外周血），置于4℃冰箱用于后續(xù)流式細胞術和ELISA檢測。收集小鼠背部實驗區(qū)皮損組織，每組取5只小鼠皮損組織（其余皮損組織置于-80℃冰箱中，用于后續(xù)Western blot檢測），迅速置于4%中性甲醛中固定24 h，用石蠟包埋，切片后使用HE染色試劑盒進行染色，用中性樹膠封固，在光學顯微鏡下觀察小鼠皮損組織病理變化。

1.2.4 流式細胞術檢測小鼠外周血Th1/Th2細胞比例 取1.2.3中置于4℃冰箱的小鼠外周血，每組1 mL，肝素抗凝，加入RPMI 1640培養(yǎng)基［含10%胎牛血清（FBS）］混懸細胞。計數并調整細胞濃度為1×106/mL，然后取1 mL混懸液加入刺激劑（含100 mg/L佛波醇酯和1 mg/L離子霉素）和阻斷劑（10 mg/L布雷菲德菌素A），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，取100μL加入流式管中。于流式管中再加入5μL表面染色劑PreCP-Cy5與5μL Anti-mouse-CD4混勻，室溫避光孵育15 min，依次加入100μL FIX&PREM中的A液，室溫避光孵育15 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清，再加入50μL FIX&PREM中的B液，其中實驗管中加雙色標記Antimouse-IFN-γ和FITC/Anti-mouse-IL-4-PE混勻，對照管中加同型對照抗體Rat IgG1-FITC/Rat IgG1-PE混勻。室溫避光孵育20 min后，加入2 mL PBS洗滌液，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，再加入1 mL PBS洗滌液后上機檢測。根據FITC-CD4熒光圈測定CD4+T細胞，計算Th1（CD4+IFN-γ+）和Th2（CD4+IL-4+）細胞百分比，并計算Th1/Th2比例。

1.2.5 ELISA檢測小鼠外周血血清中TSLP、TNF-α、IL-4和IFN-γ水平 取1.2.3中置于4℃冰箱中的小鼠外周血，每組2 mL，12 000 r/min離心10 min取血清，按照TSLP、TNF-α、IL-4和IFN-γELISA試劑盒說明書進行檢測，每組設置3個重復。

1.2.6 Western blot檢測小鼠皮損組織TSLP和OX40L蛋白表達水平 取1.2.3中置于-80℃冰箱中的各組小鼠皮損組織，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、轉膜、抗體封閉。以1︰2 000稀釋后的Anti-TSLP和Anti-OX40L一抗4℃過夜孵育，置于含辣根過氧化物酶綴合的二抗（1︰5 000）中室溫孵育2 h，ECL顯色試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照。以β-actin為參照，分析灰度值，得出蛋白表達水平，每組設置3個重復。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫草素對小鼠搔抓行為及皮膚炎性損傷的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠搔抓行為增加，皮膚炎性損傷顯著加重（P＜0.05）；與模型組相比，紫草素低、中、高劑量組小鼠第5、10、15天的搔抓行為減少，第7、15天皮膚炎性損傷依次減輕（P＜0.05）；紫草素高劑量組和陽性對照組小鼠第10、15天搔抓行為以及第15天皮膚炎性損傷程度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1、表1。

2.2 紫草素對小鼠皮損組織病理學的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠皮損組織中的表皮和真皮區(qū)域均有密集的炎性細胞浸潤，表皮增厚；與模型組相比，紫草素低、中、高劑量組小鼠皮損組織中，表皮和真皮區(qū)域炎性細胞浸潤和表皮增厚依次減輕；紫草素高劑量組與陽性對照組皮損組織中炎性細胞浸潤和表皮厚度差異不明顯。見圖2。

2.3 紫草素對小鼠外周血中Th1/Th2細胞比例的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠外周血中Th1細胞顯著減少，Th2細胞顯著增多，Th1/Th2比例顯著下降（P＜0.05）；與模型組相比，紫草素低、中、高劑量組小鼠外周血中Th1細胞依次增多，Th2細胞依次減少，Th1/Th2比例依次升高（P＜0.05），呈劑量依賴性；紫草素高劑量組與陽性對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 紫草素對小鼠血清TSLP、TNF-α、IL-4和IFN-γ水平的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠血清TSLP、TNF-α和IL-4水平顯著升高，IFN-γ水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，紫草素低、中、高劑量組小鼠血清TSLP、TNF-α和IL-4依次降低，IFN-γ水平依次升高（P＜0.05）；紫草素高劑量組與陽性對照組上述指標水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

Fig.2 Histopathological changes in skin lesions in each group of mice(HE staining,×200)圖2 各組小鼠皮損組織病理學變化（HE染色，×200）

Tab.2 Comparison of the ratio of Th1/Th2 cells inperipheral blood between the six groups of mice表2 各組小鼠外周血Th1/Th2細胞比例比較（n=15，x±s）

Tab.3 Comparison of serum levels of TSLP,TNF-α,IL-4 and IFN-γbetween the six groups of mice表3 各組小鼠血清中TSLP、TNF-α、IL-4和IFN-γ水平比較 （n=15，ng/L，x±s）

2.5 紫草素對小鼠皮損組織TSLP和OX40L蛋白表達水平的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠皮損組織TSLP和OX40L蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，紫草素低、中、高劑量組小鼠皮損組織TSLP和OX40L蛋白表達水平依次降低（P＜0.05）；紫草素高劑量組與陽性對照組小鼠皮損組織2種蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3、表4。

Fig.3 Western blot results of TSLP and OX40L protein expression in skin lesions in each group of mice圖3 各組小鼠皮損組織TSLP和OX40L蛋白表達Western blot圖

Tab.4 Comparison of TSLPand OX40Lprotein expression levels in skin lesions between the six groups of mice表4 各組小鼠皮損組織TSLP和OX40L蛋白表達水平比較（n=10，x±s）

3 討論

3.1 AD小鼠模型的特征 AD是一種因皮膚屏障功能出現障礙而產生的慢性皮膚疾病，以濕疹和嚴重瘙癢等為特點，具有復發(fā)性［10］。隨著社會工業(yè)化的不斷發(fā)展，其發(fā)病率也在逐年升高，但病因尚不明確；其中，表皮屏障通透性增加和適應性免疫功能障礙可能是AD產生的主要原因［11］。本研究通過采用局部外涂DNFB法制備AD小鼠模型，發(fā)現模型組小鼠皮損組織中表皮和真皮區(qū)域均有密集的炎性細胞浸潤，表皮增厚，搔抓行為增加，皮膚炎性損傷加重，外周血中Th2細胞、TSLP、TNF-α和IL-4水平顯著升高，Th1細胞、IFN-γ水平和Th1/Th2比例顯著下降，提示該模型構建成功且Th1/Th2平衡遭到破壞。

3.2 紫草素對AD小鼠Th1/Th2平衡的影響 紫草素作為紫草根提取物的主要活性成分，具有顯著的抗炎作用，可抑制AD患者促炎細胞因子和趨化因子的表達，緩解皮膚炎性損傷［12］。Lee等［13］研究發(fā)現，紫草素在小鼠哮喘模型中能顯著抑制過敏性炎癥和氣道高反應性，具有治療過敏性哮喘的潛力。Dai等［14］研究發(fā)現，紫草素在膠原誘導性關節(jié)炎小鼠模型中能顯著抑制Th1細胞因子表達并誘導Th2細胞因子表達，從而起到抗炎和免疫調節(jié)作用，這與本研究結果并不一致。這可能是由于膠原誘導性關節(jié)炎和特應性皮炎的進展過程是由不同的細胞因子發(fā)揮作用，因此紫草素對兩者不同細胞因子所發(fā)揮的作用也不相同。其中，Th1型細胞主要分泌IL-2、IFN-γ及TNF-α等細胞因子，參與細胞免疫反應，Th2型細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-3和IL-8等細胞因子，與體液免疫相關，Th1/Th2失衡可導致Th1型細胞功能受到抑制、Th2型細胞因子過度表達，產生多種過敏性、免疫性及炎癥性疾病［15］。另外，紫草素可以延長野生型小鼠移植皮的存活時間［16］。本研究發(fā)現，紫草素能顯著抑制AD小鼠皮損組織中表皮和真皮區(qū)域炎性細胞浸潤和表皮增厚，減少小鼠搔抓行為，減輕小鼠皮膚炎性損傷程度及降低Th2細胞、TSLP、TNF-α和IL-4水平，增加Th1細胞、IFN-γ水平及Th1/Th2比例，且呈劑量依賴性，提示紫草素能夠改善AD小鼠皮膚炎性損傷，維持Th1/Th2平衡，但其機制尚需進一步研究。

3.3 紫草素對AD小鼠TSLP/OX40L通路蛋白表達的影響 TSLP介導的信號轉導通路參與Th2型免疫反應的過程，且須通過介導樹突狀細胞表面OX40L來實現，激活TSLP/OX40L通路可抑制炎性細胞凋亡，進而增強炎癥反應［17］。Feng等［18］研究發(fā)現，TSLP/OX40L通路可能通過調節(jié)CD4+、CD25+細胞和炎性因子水平參與哮喘的發(fā)病和氣道炎癥反應。Yao等［19］研究發(fā)現，玉屏風顆粒改善免疫抑制作用的機制與樹突狀細胞介導的TSLP/OX40L通路有關。本研究發(fā)現，紫草素能顯著降低TSLP和OX40L蛋白表達水平，且呈劑量依賴性，提示紫草素可能通過抑制TSLP/OX40L通路，減輕AD小鼠皮損組織炎癥反應，維持Th1/Th2平衡，修復皮膚損傷。另外，山梨葉提取物可通過抑制AD患者控制瘙癢感覺的外周神經元中的TSLP通路發(fā)揮其止癢作用［20］；松皮提取物可通過調節(jié)Th1/Th2平衡和皮膚屏障功能，改善DNFB誘導的小鼠特應性皮炎［21］。這與本研究中紫草素通過抑制TSLP/OX40L通路維持Th1/Th2平衡、改善小鼠AD的結果一致。

綜上所述，紫草素可劑量依賴性地維持AD小鼠外周血Th1/Th2平衡，減輕炎癥反應，緩解皮膚損傷，其機制可能與抑制TSLP/OX40L通路有關。本研究為臨床使用紫草素治療AD提供了理論依據，但紫草素治療AD的具體作用機制尚需深入研究。