阿侖膦酸鈉在地塞米松誘導C2C12細胞自噬中的作用機制探討

田愛現，馬劍雄，馬信龍△，李巖

骨骼肌的功能與其肌纖維的數量和體積有關，當骨骼肌出現萎縮時，其質量會相應減少，機體的運動系統功能也會受到明顯影響，從而影響患者的身體健康，降低生活質量，老年患者尤為明顯［1］。當前對骨骼肌萎縮的研究已成為熱點。藥物治療以其獨特的優勢與良好的療效在防治骨骼肌萎縮方面發揮著重要作用。阿侖膦酸鈉（Alendronate，ALN）作為第3代雙膦酸鹽藥物，可有效抑制骨吸收，維持骨量，是治療原發性及繼發性骨質疏松的一線藥物［2］。ALN除了可治療骨質疏松癥外，還能明顯增加骨骼肌質量［3］，并能通過提高自噬、抑制骨骼肌蛋白降解等途徑抑制骨骼肌萎縮［4-5］。本研究以地塞米松（Dexamethasone，Dexa）誘導C2C12細胞肌小管萎縮，通過體外細胞實驗探討ALN在骨骼肌萎縮中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器 阿侖膦酸鈉（Merck Sharp&Dohme Italia SPA，國藥準字J20130085，600 mg/片）；地塞米松購自Sigma公司；DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司；4%中性多聚甲醛固定液、HE染色試劑盒、免疫組化試劑盒為武漢賽維爾生物科技有限公司產品；微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）、Beclin-1、肌球蛋白重鏈（MHC）抗體，肌肉特異性環指蛋白1（MuRF1）單克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的對應二抗均購自英國Abcam公司；CCK-8檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）。酶標儀（Rayto，RT6100），離心機（大龍，D3024R），成像系統（上海天能科技有限公司，Tanon-1600R），光學顯微鏡（日本，Nikon EclipseE100），Western blot電泳儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 研究方法

1.2.1 C2C12細胞培養、分化和分組 C2C12肌細胞來源于天津市骨科研究所，培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，添加1%青霉素和鏈霉素（生長培養基），細胞置于37℃、5%CO2孵箱，48 h更換生長培養基。細胞生長至70%左右時更換含2%馬血清的DMEM高糖培養基（分化培養基）繼續培養4 d，以誘導C2C12細胞肌小管形成。實驗設對照組（DMSO處理），Dexa組（100μmol/L Dexa處理），Dexa+ALN組（100μmol/L Dexa+1.0μmol/L ALN處理）。

1.2.2 CCK-8檢測細胞增殖 取對數生長期細胞，以5×103細胞/孔接種于96孔板，接種12 h后加入藥物處理。實驗設4組，ALN濃度分別為0、0.1、0.5和1.0μmol/L，設置僅含有等體積DMEM全培養基的空白孔排除培養基干擾，每組設置3個復孔。藥物處理48 h后，根據CCK-8試劑盒說明書操作，棄原有培養基，每孔加入100μL的CCK-8試劑，37℃孵育2 h。用酶標儀測定450 nm處的光密度（OD）值，計算細胞存活率，篩選ALN合適劑量。

1.2.3 C2C12細胞肌小管HE染色 細胞生長至70%左右時更換含2%馬血清的DMEM高糖培養基繼續培養4 d，棄掉培養基，加冷PBS（pH=7.4~7.6）清洗2次，每次30 s，每孔加入4%中性多聚甲醛固定液15 min，PBS清洗3次，每次5 min。每孔加入蘇木素染液2 min，適量PBS清洗3次，每次5 min。每孔加入伊紅染液30 s，適量PBS清洗3次，每次5 min。光鏡下觀察C2C12細胞肌小管情況。

1.2.4 C2C12細胞肌小管直徑和融合指數測定 C2C12細胞肌小管呈長梭形，以每條肌小管中部2/3作為其直徑測量部位，沿軸線方向測定多組數據，每組隨機拍攝3張圖。肌小管是多個C2C12細胞融合而形成的，因此以視野下肌小管中的細胞核數量占總細胞核數量的百分比評估C2C12細胞的分化程度。其計算方式：融合指數（%）=視野肌小管中細胞核數（n）/視野中細胞核總數（N）×100%。每個實驗組隨機取6張照片，最終結果取其平均值，采用Image J 1.48軟件統計肌小管直徑和融合指數。

1.2.5 Dexa刺激誘導C2C12細胞肌小管萎縮模型的建立 C2C12細胞采用分化培養基培養4 d形成肌小管，更換分化培養基，使用濃度100μmol/L的Dexa刺激24 h。

1.2.6 Western blot法檢測肌蛋白和自噬相關蛋白表達 細胞生長至70%左右時更換含2%馬血清的DMEM高糖培養基繼續培養4 d，24 h后收集各組細胞并提取總蛋白，BCA法測量蛋白濃度，經SDS-PAGE、轉膜、5%脫脂奶粉封閉，隨后加入MHC、MuRF1、LC3、Beclin-1和抗β肌動蛋白一抗（均為1︰1 000稀釋），于4℃孵育過夜，次日TBST震蕩洗滌3次，加入按比例稀釋的HRP標記的對應二抗（1∶4 000），室溫孵育60 min，TBST洗滌3次后進行ECL化學發光顯影，成像系統顯影，所有蛋白條帶灰度值定量密度分析采用Image J 1.48軟件。

1.2.7 免疫熒光檢測肌合成蛋白MHC表達 細胞生長至70%左右時更換含2%馬血清的DMEM高糖培養基繼續培養4 d，24 h后棄掉培養基，加冷PBS（pH=7.4~7.6）清洗2次，每次30 s；每孔加入4%中性多聚甲醛固定15 min，適量PBS清洗3次，每次5 min；每孔加入0.3%TritonX-100作用20 min，適量PBS清洗3次，每次5 min；每孔加入5%胎牛血清封閉液，在37℃搖床下孵育1 h；加入一抗兔源MHC（1︰1 000），4℃孵育過夜，一抗孵育結束后，加入適量PBS清洗3次，每次5 min；加入熒光標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，加入適量PBS清洗3次，每次5 min；每孔加入DAPI染細胞核，室溫孵育5 min，加入適量PBS清洗3次，每次5 min；防熒光淬滅樹脂膠封片，共聚焦顯微鏡下進行觀察。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行數據分析，計量資料以均值±標準差（x±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度ALN對C2C12細胞增殖能力的影響 結果顯示，0、0.1、0.5和1.0μmol/L ALN組細胞增殖能力組間比較差異有統計學意義（n=3，F=74.978，P＜0.01）；相較于其他濃度組，1.0μmol/L ALN組細胞增殖能力更高（P＜0.05），見圖1。因此本實驗選擇1.0μmol/L ALN進行后續實驗。

Fig.1 Effects of different concentrations of ALN on theproliferation of C2C12 cells圖1 不同濃度ALN對C2C12細胞增殖能力的影響

2.2 不同濃度ALN對C2C12細胞分化的影響 結果顯示，0、0.1、0.5和1.0μmol/L ALN處理后，1.0 μmol/L ALN組相較于其他組的細胞分化能力更高，其肌小管直徑最大、肌小管融合指數最高（P＜0.05），見圖2。

2.3 ALN對Dexa誘導C2C12細胞肌蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與對照組相比，Dexa組細胞MuRF1蛋白表達水平升高（1.00±0.00vs.2.46±0.12），Dexa+ALN組中MuRF1蛋白表達水平（0.67±0.03）較Dexa組顯著下調，組間比較差異均有統計學意義（n=3，F=337.335，P＜0.01)，見圖3。免疫熒光結果顯示，與對照組相比，Dexa組肌小管萎縮，并且MHC蛋白熒光表達強度（紅光）明顯降低，Dexa+ALN組MHC蛋白熒光表達強度表達較Dexa組顯著升高，見圖4。

Fig.2 Effects of different concentrations of ALN on the differentiation of C2C12 cells圖2 不同濃度ALN對C2C12細胞分化的影響

Fig.3 Western blot assay showed the effect of ALN on the expression of MuRF1 protein induced by Dexa in C2C12 cells圖3 Western blot法檢測ALN對Dexa誘導C2C12細胞MuRF1蛋白表達的影響

2.4 ALN對Dexa誘導C2C12細胞自噬水平的影響 Western blot結果顯示，與對照組相比，Dexa組自噬信號通路相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表達水平較對照組顯著下調（P＜0.05），Dexa+ALN組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表達較Dexa組顯著上調（P＜0.05），見圖5、表1。

Fig.4 The effects of ALN on Dexa-induced MHC protein expressions in C2C12 cells detected by immunofluorescence圖4 免疫熒光檢測ALN對Dexa誘導C2C12細胞MHC蛋白表達的影響

Fig.5 Western blot assay showed the effect of ALN on Dexa-induced autophagy in C2C12 cells圖5 Western blot法檢測ALN對Dexa誘導C2C12細胞自噬水平的影響

Tab.1 Comparison of the expression levels of autophagy related proteins between three groups of C2C12 cells表1 各組C2C12細胞中自噬相關蛋白表達水平比較（n=3，x±s）

3 討論

3.1 雙膦酸鹽類抗骨質疏松藥物在骨骼肌中的作用 雙膦酸鹽類抗骨質疏松藥物對骨骼肌生長和功能的影響目前尚存在爭議。Yoon等［6］研究表明雙膦酸鹽中的帕米膦酸鹽對杜氏肌萎縮癥小鼠模型具有增加骨骼生長和提高骨骼肌功能的作用。B?rsheim等［7］認為，帕米膦酸鈉可通過調節骨骼肌蛋白的合成和分解來減輕骨骼肌萎縮，并提高燒傷后患者的骨骼肌力量。Uchiyama等［8］發現32例骨質疏松癥患者服用雙膦酸鹽治療3年后，股骨周圍骨骼肌密度明顯改善。Widrick等［9］研究結果也表明一定劑量的ALN在可以增加去勢大鼠骨量，但對骨骼肌功能沒有影響。Shiomi等［10］研究發現100μmol/L ALN可抑制人肌細胞的增殖和分化。本研究發現，與0、0.1和0.5μmol/L ALN組相比，1.0μmol/L ALN組能夠顯著促進C2C12細胞增殖和分化，增加肌小管直徑和肌小管融合指數，并顯著改善Dexa誘導的C2C12細胞肌小管萎縮，促進骨骼肌合成蛋白MHC表達上調，抑制肌降解蛋白MuRF1的表達。

3.2 自噬信號通路相關蛋白在骨骼肌細胞中的作用 LC3是自噬標志蛋白之一。LC3作為一種前肽可產生含C末端的肽，并釋放到細胞質中。LC3-Ⅰ通過Atg7和Atg3將磷脂酰乙醇胺偶聯，生成脂質化形式的LC3，也稱作LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ廣泛存在于真核生物中，其表達程度與自噬活性密切相關。LC3-Ⅱ可被整合到細胞膜中，并與LC3-Ⅰ強烈結合，常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ來評價自噬水平［11］。研究發現，小鼠在跑臺運動1 h或急性鈍挫傷干預后，骨骼肌細胞的自噬標志蛋白含量均明顯升高［12］。Takegaki等［13］發現過度訓練能抑制骨胳肌降解蛋白表達，激活自噬信號通路，使ULK1 Ser757和Ser555磷酸化，LC3-Ⅱ表達增加。Kotani等［14］研究發現，反復的電刺激可通過磷酸化自噬啟動因子（ULK1）減弱雷帕霉素靶蛋白復合體1（mTORC1）活性，激活自噬體LC3的形成。本研究體外實驗結果顯示，100μmol/L Dexa處理C2C12細胞24 h后，1.0μmol/L ALN通過上調LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白含量，增加肌小管內肌合成蛋白MHC表達，抑制肌降解蛋白MuRF1表達，有效改善Dexa誘導的骨胳肌萎縮，促進骨骼肌再生。ALN對骨骼肌萎縮的逆轉，可能與刺激肌小管形成有關。

綜上所述，抗骨質疏松藥物ALN可以通過上調自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表達，抑制肌降解蛋白MuRF1表達，顯著預防體外Dexa誘導的細胞肌小管萎縮。